2000 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝子ハンドリング技術を用いた単一細胞内調節タンパク質の機能解析法の開発
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11559016
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
石渡 信一 早稲田大学, 理工学部, 教授 (10130866)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤田 英明 日本学術振興会, 特別研究員 (50318804)
岡野 和宣 (株)日立製作所, 中央研究所, 主任研究員
安田 賢二 東京大学, 総合文化研究科, 助教授 (20313158)
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| Keywords | ケージド遺伝子 / 温度パルス法 / DNAチップ / PCR法 / 筋芽細胞 / GFP-アクチン / アクチンフィラメント / ストレスセンサー |
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| Research Abstract |
Caged DNA合成の試み:Cagedのための一つの方策として、DNA塩基のアミノ基をDMNBB(4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl bromide)で化学修飾し、DNAの複製機能を一旦失活させ、それを紫外線マイクロフラッシュ法によって再活性化する、という方針で不活性化DNAの合成を試みた。一時はPCR法によって確認できたと思われたが、再現性に問題があり、結局DNA塩基のアミノが化学修飾に対して活性が高くない、という結論に達した。さらに、Caged遺伝子を調製したという論文が数編発表されたので、我々は方針を転換し、目的の研究課題の鍵となる新手法の開発に力を入れた。DNAの固定化と選択的回収法:クロム基盤上へのDNA固定化法と、赤外レーザー照射・温度パルス法による選択的な回収法を確立し、その方法の詳細を論文として公表した。GFP-アクチンの心筋培養細胞内発現:ニワトリの未分化筋芽細胞・マウス筋芽細胞株C2C12へ、蛍光タンパク質GFPをfusionしたアクチンのプラスミドを導入すること、そしてその未分化細胞を筋管へと分化させることを試みた。その過程でGFP-アクチンがどのように筋収縮系に組み込まれるかを、共焦点蛍光顕微鏡を用いて解析している。アクチンフィラメントのストレスセンサー応用:アクチンフィラメントに加わる張力を蛍光画像化し、アクチンフィラメントをストレスセンサーとして利用するための方法を開発しようと、幾つかの試みをした。特殊なGFP-アクチンを発現させ、加わる力に応じて生じるタンパク質歪みを蛍光画像化できるか否かを検討している。ケモカインリセプターの1分子画像化:細胞表面でケモカインリセプターを1分子蛍光画像化し、ケモカイン結合に伴う走化性と、レセプターの集合性や運動性を顕微鏡解析した。リセプターが2量体を形成するか否かに注目している。
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Research Products
(7 results)
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[Publications] 岡野和宣 ら: "DNAプローブアレイを用いたDNA断片回収"電気学会誌(センサーマイクロマシン部内誌). 4月号(印刷中). (2001)
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[Publications] Kawaguchi,K.and Ishiwata,S.: "Nucleoside-dependent single-to double-headed binding of kinesin"Science. 291. 667-669 (2001)
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[Publications] Nishizaka,T. et al.: "Characterization of single actomyosin rigor bonds.-Load-dependence of lifetime and mechanical properties-"Biophys.J.. 79. 962-974 (2000)
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[Publications] Kawaguchi,K.& Ishiwata,S.: "Temperature dependence of force, velocity and processivity of single kinesin melecules."Biochem.Biophys.Res.Comm.. 272. 895-899 (2000)
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[Publications] Okano,K, et al.: "Position specific release of DNA from a chip by using photothermal denaturation."Sensors & Actuators. B64. 88-94 (2000)
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[Publications] Yasuda,K. et al.: "Focal extraction of surface-bound DNA from a microchip using photo-thermal denaturation."Biotechniques. 28. 1006-1011 (2000)
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[Publications] Ishiwata,S. et al.: "Molecular Interactions of Actin (eds.C.G.dos Remedios & D.D.Thomas)"Springer Verlag, Heidelbery. 269 (2000)
