レーザマイクロダイセクションによる染色体特異的DNAライブラリーの構築

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11660005
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 村田 稔 岡山大学, 資源生物科学研究所, 教授 (20166292)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小倉 豊 岡山大学, 資源生物科学研究所, 助手 (60224193) ; 坂本 亘 岡山大学, 資源生物科学研究所, 助教授 (20222002)
• Keywords: コムギ / 染色体DNAライブラリー / テロソーミック染色体 / マイクロダイセクション / DOP-PCR / 反復配列 / FISH / レトロトランスポゾン

Research Abstract

コムギのダイテロソーミックスを用いて、特異的なテロ染色体1ALと1BLをマイクロダイセクションにより切り取り、そのDNAを増幅した。これまでは、テロ染色体以外の染色体をレーザにより消去し、残ったテロ染色体を鋭利なガラスニードルで削り取る操作を行ってきた。しかし、レーザを照射する際に染色体断片が飛び散り、ターゲットとする染色体上に残ることが考えられたため、レーザ照射を極力省き、直接ガラスニードルで削り取ることにした。その結果、4,5本のテロ染色体からでも十分なDNA増幅が行えた。増幅したDNAをプローブとしてFISH(蛍光in situハイブリダイゼイション)を行ったところ、特異的なシグナルは得られず、すべてのコムギ染色体の全体にシグナルが観察された。これは、増幅DNAに含まれている散在型反復配列(レトロトランスポゾン様配列など)によるものと考えられた。また、特異的に増幅するミニサテライトなども検出された。
これまでの解析から、増幅したDNA断片には、ESTや既知遺伝子のコーディング領域とホモロジーを示す配列がかなりの割合(〜40%)で含まれていることがわかった。そこで、これら遺伝子に相当するcDNAの直接選抜を試みた。プローブには、マイクロダイセクトした染色体からDOP-PCRで増幅したDNAを用い、これをビオチン化した。cDNAは、幼穂からポリA^+mRNAを抽出した後、SMART(クロンテック)により合成した。cDNAには、マイクロサテライトを含むものがあるため、ゲノミックDNAから調整したCot1 DNAをプレハイブリダイゼイションの段階で加えた。2回の直接選抜を行い、PCRを行ったところ、スメアの中に数本のバンドが観察された。現在、増幅したcDNAの解析を進めている。

Research Products

• [Publications] 村田稔: "マイクロダイセクションによるコムギの染色体DNAライブラリーの構築.I.第1同祖群染色体長腕の特性"育種学研究. 2(別1). 27 (2000)
• [Publications] 村田稔: "マイクロダイセクションによるコムギの染色体DNAライブラリーの構築.II.部位特異的cDNAクローンの直接選抜"育種学研究. 2(別2). 31 (2000)
• [Publications] Murata,M.: "Construction of chromosome-specific DNA libraries by laser-microdissection."Abstracts of Plant & Animal Genome IX. 94 (2001)
• [Publications] Murata,M.: "Construction of chromosome-specific DNA libraries by laser-microdissection."Wheat Inf.Serv.. 92(In press). (2001)