BHC分解菌由来新規脱塩化水素酵素の反応機構及び細胞内局在化機構の解明

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11660075
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 永田 裕二 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助手 (30237531)
• Keywords: BHC / 環境汚染物質 / Sphingomonas / 脱塩化水素酵素 / デハロゲナーゼ / 細胞内局在性 / ペリプラズム

Research Abstract

γ-HCH分解菌Sphingomonas paucimobilisUT26由来のγ-hexachlorocyclohexane(HCH)dehydrochlorinase(LinA)は,補因子なしにγ-HCHから直接脱塩化水素を行うが,一時配列上の相同性を示す酵素が存在せず,その反応機構・起源については全く不明である。本年度は,LinAの反応機構の解明を目的とし,LinAの立体構造予測及び活性中心のアミノ酸残基の同定を行った。
コンピューターを用いた立体構造予測により,LinAは,既に立体構造が解かれているscytalone dehydratase,steroid Δ-isomerase,nuclear transport factor2,naphthalene 1,2-dioxygenase の β-subunitと立体構造上の相同性を示すことが予測された。これらの蛋白質は異なる酵素活性を有するが,立体構造上の相同性を示すことが知られている。部位指定変異導入とランダム変異導入により20種類以上のLinAの変異酵素を作製し,これらを大腸菌中で高発現し,野生型酵素と活性を比較した。その結果,活性を失った変異酵素は予想立体構造上の活性中心あるいはその近傍に変異が入っているのに対して,活性を残している変異酵素は酵素の表層部分に変異が入っているという傾向が見られたことから,予想立体構造の妥当性が確認された。また,LinAの活性にはAsp25とHis73のペアによるプロトンの引き抜きが必須であることが明らかになった。この,Asp-Hisのペアによるプロトンの引き抜きはscytalone dehydrataseの活性にも必須であり,LinAが脱水酵素から脱塩化水素酵素に進化したものである可能性が強く示唆された。

Research Products

• [Publications] I. Smatanov ら: "Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of halsalkane dehalogenase Lin B from Sphingomonas paucimobilis UT26"Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. D55. 1231-1233 (1999)
• [Publications] Y. Nagata ら: "Two different types of dehalogenase LinA and LinB, which are involved in the γ-HCH degradation in S.paucimobilis UT26, are localized in ‥‥"J. Bacteriol.. 181. 5409-5413 (1999)
• [Publications] Y. Ohtsubo ら: "PcpA, which is involved in the degradation of pentachloropherol in S.chlorophenolica ATCC39723, is a novel type of ‥‥"FEBS Lett.. 459. 395-398 (1999)
• [Publications] Y. Nagata ら: "Construction and characterization of histidine-tagged haloalkane dehalogenase (LinB) of a new substrate class from a ‥‥"Protein Expression and Purification. 17. 299-304 (1999)
• [Publications] K. Miyauchi ら: "Cloning and sequencing of a novel meta-cleavage dioxygenase gene whose product is involved in the degradation of γ-HCH in S.paucimobilis"J. Bacteriol.. 181. 6712-6719 (1999)
• [Publications] Y. Nagata ら: "Complete analysis of genes and enzymes for γ-hexachlorocyclohexane degradation in Sphingomonas paucimobilis UT26"J. Industrial Microbiology & Biotechnology. 23. 380-390 (1999)