2000 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
11660081
|
|---|
| Research Institution | Shizuoka university |
|---|
Principal Investigator |
田原 康孝 静岡大学, 農学部, 教授 (30022320)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
徳山 真治 静岡大学, 農学部, 助教授 (60283347)
|
|---|
| Keywords | 納豆菌 / Bacillus subtilis / γ-ポリグルタミン酸シンテターゼ / γ-ポリグルタミン酸 / ywsC-ywtABC遺伝子 / γ-ポリグルタミン酸合成遺伝子 / 遺伝子破壊 |
|---|
| Research Abstract |
納豆菌(Bacillus subtilis IFO16449)のγ-ポリグルタミン酸(PGA)の生合成に関与する遺伝子をクローニングした。クローン化したDNA断片(4.2Kb)に、B.subtilis168で報告されているywsC、ywtABCとほぼ同一の塩基配列を示す4つの遺伝子を同定し、これらの遺伝子がPGA合成に関与する遺伝子であることは、このDNA断片を形質転換した大腸菌(E.coli JM109)がPGAを生産したことによって確かめられた。納豆菌NR-1のこれら4つの遺伝子(ywsC-ywtABC)の機能を明らかにするために、ywsC、ywtA、ywtBの3つの遺伝子破壊株を作製した。ywsCとywtAの2つの遺伝子破壊株はPGAをまったく合成しなかったが、ywtB遺伝子破壊株は少量のPGAを合成した。これらの結果から、納豆菌NR-1のPGA合成には少なくともywsCとywtAの2つの遺伝子が必要であり、ywtC遺伝子はPGAの大量生産に関わる遺伝子であることが示された。
ywsC遺伝子(1182bp)とその上流約1Kbを含むDNA断片の下流に、ywsC遺伝子のC末端にヒスタグコドンを付与した断片(300bp)とPGAオペロンの転写終結配列を含む断片(150bp)のPCR増幅物を連結させ、これをpHY300PLKベクターに挿入し、この組換えプラスミドを納豆菌のywsC遺伝子破壊株に形質転換した。形質転換株にヒスタグ抗体でYwsCタンパク質(分子量44K)の生産とPGA合成を確認したのち、菌体破壊液からニッケルアフィニテイークロマトによってYwsCタンパク質を精製した。精製タンパク質を^<14>C-L-グルタミン酸、ATP、マンガンイオンを含む反応液に加えて反応させ、^<14>C-PGAを反応生成物として検出した。この結果は、YwsCタンパク質がL-あるいはD-グルタミン酸をγ-グルタミル結合させてPGAを合成するPGAシンテターゼであることを強く示唆している。
|
-
[Publications] Y.Urushibata,S.Tokuyama and Y.Tahara: "γ-Polyglutamic acid production by a Bacillus subtilis IFO16449 mutant defective in glutamate synthase"J.Biosci.Bioeng.. (発表予定).
-
[Publications] Y.Urushibata,S.Tokuyama, and Y.Tahara: "Chracterization of ywsC gene of Bacillus subtilis involved in γ-polyglutamic acid production"J.Bacteriol.. (発表予定).
