制限酵素の機能ドメイン間シグナル伝達機構の解析

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11660092
• Research Institution: Tottori University
• Principal Investigator: 喜多 恵子 鳥取大学, 工学部, 助教授 (70234226)
• Keywords: 制限酵素 / 高発現ベクター / 結晶化 / フォールディング / 融合蛋白質 / アフィニティーカラム

Research Abstract

IIS型制限酵素はDNA認識機能ドメインとDNA切断機能ドメインから構成されており、マグネシウムイオンの存在下で、DNAの認識配列に結合した酵素のドメイン間のコンホメーションが変化した後、第二の酵素分子との間で一時的に二量体を形成して、特異的切断反応を触媒するというモデルが提唱されている。本研究では、IIS型制限酵素StsIの分子内および分子間ドメインのシグナル伝達機構を明らかにすることを目的として、酵素の立体分子構造を解析するための試料調製を行った。まず、昨年度構築したStsI大量発現菌株から精製した酵素標品を用いて、結晶化条件の検討を行った。市販の結晶化試薬を用いてスクリーニングを行ったが、結晶は得られなかった。そこで、His-tag融合酵素標品の活性と純度を再確認した結果、野生型と比較して比活性が約10分の1に低下するとともに、保存中に特異的な分解が進行することが明らかとなった。His-tagが付加することにより立体障害が起こること、His-tagに対するアフィニティー精製過程で還元剤が添加できないため、野生型と同等の機能を持つ蛋白質へのフォールディングが妨げられた結果と考え、His-tagが融合しない野生型酵素の大量発現系を再構築して酵素精製を行った。その結果、約50mgの野生型酵素標品が取得できた。ハンギングドロップ法を用いて、結晶化条件の検討を行っている。