2001 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
11660092
|
|---|
| Research Institution | TOTTORI UNIVERSITY |
|---|
Principal Investigator |
喜多 恵子 鳥取大学, 工学部, 助教授 (70234226)
|
|---|
| Keywords | 制限酵素 / 機能ドメイン / 高発現 / 融合蛋白質 / DNA結合活性 / キメラ酵素 / 人工酵素 / フォールディング |
|---|
| Research Abstract |
IIS型制限酵素は,DNA認識機能ドメインとDNA切断機能ドメインから構成されており、マグネシウムイオン存在下で、DNA上の認識配列に結合した酵素のドメイン間のコンフォメーションが変化したのち、第二の酵素分子との間で一時的に二量体を形成して、特異的な切断反応を触媒するというモデルが提唱されている。本研究では、IIS型制限酵素StsIの分子内および分子間ドメインのシグナル伝達機構を明らかにし、得られた知見をもとに、天然には存在しない特異性を持つDNA結合蛋白質とのキメラ酵素を構築することを目指した。
まず、エラー・プローンPCR法を用いて、DNA切断活性を消失した変異酵素を取得した。ごれら変異酵素の諸性質を解析するため酵素の大量発現系を構築したが、インクルージョンボディーを形成したので、可溶化条件の検討を行った。塩酸グアニジンで不溶性蛋白質を変性したのち、再生溶液に瞬時希釈することによりリフォールディングが可能になり、X種類の変異酵素を電気泳動的にほぼ均一に精製して、分子間ドメインの相互作用を解析した結果、DNA切断反応の際に形成される二量体のうちの一方の酵素分子は、必ずしもDNAに結合している必要がないことを明らかにした。
次に、野生型StsIの立体構造を解析するため、大腸菌を宿主として大量発現系を構築し、酵素の精製を行った。野生型酵素はM9培地を用いて25℃で培養を行うことにより、可溶性画分への大量発現が可能となった。His-tagが付加した酵素と付加していない酵素について、市販の結晶化試薬を用いて結晶化条件の検討を行ったが、結晶は得られなかった。
|
