1999 Fiscal Year Annual Research Report
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11660094
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
徳永 正雄 鹿児島大学, 農学部, 教授 (20112782)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石橋 松二郎 鹿児島大学, 農学部, 助手 (20305163)
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| Keywords | DnaK / 好塩菌 / Nucleoside diphosphate kinase |
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| Research Abstract |
高度好塩菌Halobacterium cutirubrumを培養し、様々な濃度のNaCLを含むbuffer中で菌体破砕し、ATP Sepharoseカラムにかけたところ、4M食塩存在下で最も大量のDnaK蛋白がカラムに吸着した。2M以下では吸着がみられず、蛋白のnativeな構造を保つ為には、高濃度の塩が必要なことが示唆された。この蛋白をコードしている遺伝子dnakをpETベクターにつなぎ、大腸菌で発現させたところ、SDS-PAGEでその生産物に相当する新しい蛋白質のバンドを検出できた。しかし、この蛋白はATPカラムに吸着せず、正しい高次構造を持っていないことが判明した。今後、塩を加えるなどして正しいfoldingの条件を検討する。一方、同じく高度好塩菌のNucleoside diphosphate Kinase(NDK)蛋白のN末端アミノ酸配列を決定する目的で、PVDF膜にブロットし、蛋白バンドを切り出し分析した。このアミノ酸配列をもとにして、PCRプライマーを設計し、ゲノムDNAをテンプレートにしてDNA断片を増幅した。約120bpの断片が増幅されたので、pBR322にクローニングしその塩基配列を決定したところ、予想のアミノ酸配列をコードしていた。
この断片を用いて、遺伝子全領域をクローニングすべくゲノムDNAのサザン解析を行っている。
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