多量体α-グルコシダーゼの耐熱化機構と機能発現の解析

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11660095
• Research Institution: Kyoto Prefectural University
• Principal Investigator: 鈴木 譲 京都府立大学, 農学部, 教授 (50046471)
• Keywords: 6量体α-グルコシダーゼIII / 遺伝子クローニング / グリコシルヒドロラーゼ・フアミリー31 / 2次構造解析 / 耐熱性酵素 / Bacillus thermoamyloliquefaciens / 好熱菌 / サブユニット解離会合

Research Abstract

多量体構造のサブユニット間相互作用が好熱菌タンパク質の熱環境への適応戦略となるか否かの分子的基礎情報を得るため、30-66℃の温度領域で生育する通性好熱菌Bacillus thermoamyloliquefaciens KP1071の72℃の150mMリン酸緩衝液(pH6.8)内で10分の半減期を示す分子量530,000のサブユニット解離会合性ホモ6量体α-グルコシダーゼIIIのサブユニットをコードする遺伝子をクローニングし、その遺伝子構造を解析した。その結果、1)酵素サブユニットをコードする遺伝子はpUC19に挿入された3.8-kbp HindIII DNA断片としてクローニングされた;2)本DNA断片は開始コドンATGと終止コドンTAAを保持する2310bpのオープンリーディング・フレームを含み、フレームは770残基よりなる分子量88,620のタンパク質に対応した;3)開始コドン5'上流にはシャイン・ダルガルノ配列とプロモーター・-35/-10配列に対応する配列(AGGAGT;GATGAGG/AAGAAT)が出現した;4)終止コドン3'下流には対称逆方向反復配列(AATGTCATCAA)が出現した;5)大腸菌で発現され均一に純化された酵素は、免疫学的特性、分子特性(ホモ6量体構造、サブユニットとオリゴマーの分子量、N末端配列、塩濃度と温度依存サブユニット解離会合性、耐熱性など)や触媒特性では天然型酵素と一致した;6)酵素サブユニットの一次配列は、グリコシルヒドロラーゼ・ファミリー31に属するB.thermoamyloliquefaciensサブユニット非解離性ホモ6量体α-グルコシダーゼII(分子量540,000)のサブユニットの一次配列と32%、古細菌Sulfolobus solfataricus 98/2α-グルコシダーゼの一次配列と28%、、8の真核生物由来のα-グルコシダーゼの一次配列と24-30%一致した;7)他のα-グルコシダーゼと同様に、α-グルコシダーゼIIIのサブユニットは三つの二次構造領域、即ち、β構造のN末端領域、二つの触媒残基Asp383とAsp451を含むα/βまたはα+β構造の中央領域、β構造のC末端領域から構成されるβ(α/β)βまたはβ(α十β)βのサンドウイッチ構造の二次構造トポロジー・モチーフをとる、ことが判明した。

Research Products

• [Publications] K.Kato,T.Araki,T.Kitamura,N.Morita,M.Moori,Y. Suzuki: "Purification and properties of a thermostable inulinase (β-D-fructan fructohydrolase) from Bacillus stearothermophilus KP1289"Starch/Staerke. 7. 253-258 (1999)
• [Publications] S.Kashiwabara,S.Ogawa,N.Miyoshi,M.Oda,Y.Suzuki: "Three domains comprised in thermostable molecular weight 54,000 pullulanase of type I from Bacillus flavocaldarius KP1228"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 63. 1736-1748 (1999)
• [Publications] Y.Suzuki: "The proline rule-A strategy for protein thermal stabilization"Proc.Jpn.Acad.Ser.B Phys.Biol.Sci.. 75. 133-137 (1999)
• [Publications] K.Watanane,T.Iwashima,Y.Suzuki: "Features of dnaKoperon genes of the obligate thermophile Bacillus thermoglucosidasius KP1006"Antonie van Leeuwenhoek. 77. 241-250 (2000)
• [Publications] S.Kashiwabara,S.Azuma,M.Tsuduki,Y.Suzuki: "The primary structure of the subunit in Bacillus thermoamyloliquefaciens KP1071 molecular weight 540,000 homohexameric α-glucosidase II belonging to the glycosyl hydrolase family 31"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64. 1379-1393 (2000)
• [Publications] K.Watanabe,Y.Fujita,M.Usami,A.Takimoto,Y.Suzuki: "Thermodynamic analysis of Bacillus cereus oligo-1,6-glucosidase and its cumulatively proline-introduced mutantproteins by differential scanning calorimetry"J.Mol.Catal.B : Enz.. 10. 257-262 (2000)
• [Publications] K.Watanabe,T.Yamamoto,Y.Suzuki: "Renaturation of Bacillus thermoglucosidasius HrcA repressor by DNA and thermostability of the HrcA-DNA complex in vitro"J.Bacteriol.. 183. 155-161 (2001)