Yeast two hybrid法による分泌顆粒への蛋白選別輸送機構の解析

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11670011
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 渡部 剛 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (80220903)
• Keywords: クロモグラニン / セクレトグラニン / 分泌顆粒 / 内分泌細胞 / Yeast Two Hybrid / 蛋白選別輸送 / ペプチドホルモン / 蛋白間相互作用

Research Abstract

グラニン蛋白群と総称される一群の酸性分泌蛋白は8内分泌細胞に特異的に発現し、分泌顆粒の形成やペプチドホルモンの選別輸送に関与することが示唆されている。そこで本研究では、これらの蛋白が他のどのような機能分子と相互作用を持ち共同して機能を果たしているかについて、Yeast two hybrid法を用いて解析を進めている。平成11年度にはまず、代表的なグラニン蛋白であるラットクロモグラニンA(CgA)、クロモグラニンB(CgB)、セクレトグラニンII(SgII)のN末端からC末端までの全長を、酵母Gal4蛋白のDNA結合ドメイン(baitベクター)および転写活性化ドメイン(preyベクター)に融合させたベクターを系統的に構築した。これらのベクターをまず単独で酵母細胞に導入し、この実験系でグラニン蛋白と相互作用を有する蛋白が探索できるかどうか検討した。
その結果、グラニン蛋白のうちCgAについては、baitベクターおよびpreyベクター単独では、Gal4プロモーター下流のレポーター遺伝子His3の発現が誘導されず、この実験系を用いて既知あるいは未知の蛋白との相互作用を検討できることが確認された。これに対して、CgBとSgIIについては、baitベクターあるいはpreyベクター単独でもHis3の発現が誘導されてしまい、このベクターを用いる限り、他の蛋白との相互作用については解析できないことが判明した。
平成12年度以降は、以上の実験結果を踏まえて、CgAに関しては、この実験系を用いてCgAと相互作用をする蛋白の探索を行い、分泌顆粒形成やホルモン選別輸送の分子機構の解析を進めていく予定である。また、CgBとSgIIに関しては、これらの蛋白の全長ではなく、部分配列をGal4蛋白のDNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインに融合させ、他の蛋白との相互作用の解析を試みる予定である。