新しいタイプの膜結合型グアニル酸シクラーゼの構造と機能調節及び病態時の役割

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11670091
• Research Institution: 佐賀医科大学
• Principal Investigator: 麻川 武雄 佐賀医科大学, 医学部, 教授 (50028362)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡本 英昭 佐賀医科大学, 医学部, 助手 (70315183) ; 高野 正子 佐賀医科大学, 医学部, 助手 (00154807)
• Keywords: グアニル酸シクラーゼ / cyclic GMP / ATP / 情報伝達 / 環状ヌクレオチド

Research Abstract

私共が発見した2つの新しいタイプの膜結合型グアニル酸シクラーゼ(以下GCと略記)、すなわち、1)SH感受性ATP依存性GC(略称SAT-GC)2)GTP,Ca要求性不飽和脂肪酸依存性GC(略称CFG-GC)について、酵素分子としての性質を明かにすると共にcDNAクローニングとタンパク構造の解析を行う。特にSAT-GCは膜からの可溶化と高度精製が容易でないが成功させることを今年度の第一の目標とした。
A.SAT-GCの膜からの可溶化に成功したが、可溶化標品は不安定であり、氷中12hでSAT-GCとしての性質が完全に消失する。そこでSAT-GCとしての性質を安定に保持できる条件を精力的に検討し、4日以上安定に保持できる条件を確立できた。この条件下にて3種類の親和クロマトを連続的に実施し、高収量でSAT-GCの高度精製標品を得ることに成功した。現在得ているSAT-GC精製標品は、可溶化前の本酵素と同様に、活性化因子により活性が促進され、氷中3日以上安定である。さらに、もう一方のGCであるCFG-GCの精製過程で私共が発見したCFG-GCのmodulator(38K)(GCMと命名)は膜結合状態のSAT-GCには無効果であるが、精製したSAT-GCでは、このGCMが活性を著明に促進することが判明した。従ってSAT-GCの活性調節機構にGCMが関与する可能性がでてきた。
B.精製酵素量が微量であることが予想されるため、既知のGCの触媒領域のアミノ酸配列に基づいてディジェネレートプライマーをデザインし、脳のcDNAライブラリーに対して3'-RACEを、さらにネスティッドPCRを行い、得られた262クローンについて検索したが、新規のGCは見つからなかった。現在ラット肺のライブラリーに対して同様のクローニングを行い、得られた302クローンの解析を行っているところである。

Research Products

• [Publications] Takeo Asakawa: "Properties of GCM and the effect of sphingolipid on membrane-bound guanylate cyclase of rat brain and lung"The Japanese Journal of Pharmacology. 79・SupI. 68 (1999)
• [Publications] Shiwen Luo: "Purification and the effect of sphingolipids on the activity of particulate,SAT-guanylate cyclase of rat lung"The Japanese Journal of Pharmacology. 82・SupI. 145 (2000)
• [Publications] 高野正子: "新しいタイプの膜結合型グアニル酸シクラーゼ活性へのSphingolipidの効果について"生化学. 71・8. 899 (1999)
• [Publications] 頼 仲平: "新しいタイプの膜結合型グアニル酸シクラーゼ活性,SAT-GCへのSphingolipidの効果について"日本薬理学雑誌. 115・3. 80 (2000)