コラーゲン結合性セルピンCaspinの機能と骨軟骨関節疾患における動態の解析

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11670228
• Research Institution: Aichi Medical University
• Principal Investigator: 佐賀 信介 愛知医科大学, 医学部, 教授 (40144141)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石黒 直樹 名古屋大学, 医学部, 講師 (20212871) ; 小崎 健一 愛知県がんセンター, 病態学研究室, 主任研究員 (50270715) ; 吉川 和宏 愛知医科大学, 医学部, 講師 (60109759)
• Keywords: caspin / PEDF / コラーゲン / 血管新生 / deletion mutants / 軟骨分化 / 抗ヒトcaspin抗体

Research Abstract

caspin cDNAを発現ベクターpQE30に組み込み、His-tagを持つrecombinant caspinをE.coliで発現させ、精製した。一部は可溶性であったが、かなりの画分が変性のため不溶性となった。より確かな生理活性を持つrecombinantsを得るため、哺乳動物細胞での発現系を確立した。pcDNA3.0にIL2 receptorのシグナル配列、Flag-tag、mouse laminin γ鎖を組み込んだpBFXベクターを用いて、COS-7細胞でFlag-tagを持つrecombinantsとして発現を確認した。さらに、caspinの機能ドメインを解析するために、C末端側から順にexonに一致した部位で欠失した6種のdeletion mutantsを組み込み、COS-7細胞での発現を確認した。現在、これらのmutantsをmouse大腸癌細胞NM11にトランスフェクションして安定産生株の樹立を行っている。今後、各deletion mutantsを抗Flag抗体カラムで精製して、caspinがコラーゲンに結合するドメインを解析する予定である。さらに、最近になってcaspin(PEDF)が血管新生阻害作用を持つことが報告されたので、これらのdeletion mutantsを用いて、血管新生阻害の機能ドメイン解析を行うべく、rat aorta ring assay、in vitro tube formation assayなどの準備を進めている。マウスATCD5細胞の軟骨分化に伴うcaspinの発現の変化をウエスタンブロティングで解析したが、細胞数の変動因子が大きく正確な解析ができなかったため、現在、RT-PCR法を用いて解析を進めている。ヒトcaspinのアミノ酸配列のうちシグナルペプチドを除いたN末端の20-37残基、214-236残基、327-343残基のペプチドを家兎に免疫して、特異性の高い3種の抗ヒトcaspin抗体を作製し、ペプチド固相化カラムを用いて、アフィニティ精製した。現在、これらの抗体を用いて、ヒトcaspin測定のためのELISA法を確立しつつある。