コラーゲン結合性セルピンCaspinの機能と骨軟骨関節疾患における動態の解析

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11670228
• Research Institution: Aichi Medical University School of Medicine
• Principal Investigator: 佐賀 信介 愛知医科大学, 医学部, 教授 (40144141)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石黒 直樹 名古屋大学, 大学院・医学部, 講師 (20212871) ; 小崎 健一 愛知医科大学, 医学部, 助手 (50270715) ; 吉川 和宏 愛知医科大学, 医学部, 講師 (60109759)
• Keywords: caspin / PEDF / 血管新生抑制 / アポトーシス / 軟骨分化

Research Abstract

前年度にCOS-7細胞で発現を確認した6種のヒトcaspin deletion mutantsをNM11細胞にトランスフェクションして安定産生株の樹立を試みたが、残念ながら高発現株を得ることができず、コラーゲン結合ドメインや血管新生抑制ドメインの解析は今後の課題となった。また、E.coliで発現させた不溶性のrecombinant caspinを精製して、家兎に免疫して抗ヒトcaspin抗体を作製した。この抗体と以前に作成した3種の抗caspinペプチド抗体と合わせ、サンドイッチELISA法を確立したが、比較的低感度であったため、ヒト試料中のcaspinを定量できるまでには至っていない。
E.coli発現のcaspinを未変性下で精製すれば、収率は極めて低いが活性を保持した蛋白として精製できることが判明した。これを用いてrat aorta ring assay、in vitro tube formation assayを行い、その血管新生抑制作用を確認した。さらに培養内皮細胞にcaspinを作用させると、内皮細胞特異的に細胞死を誘導することをつきとめた。DNAの断片化、細胞膜へのAnnexin V結合性の変化、カスパーゼ3の活性の上昇などから、内皮細胞に特異的なアポトーシスがcaspinによる血管新生抑制作用のメカニズムであることが示唆された。
insulinを添加して軟骨分化を誘導したATCD5細胞におけるcaspinの発現をウエスタンブロティング、real time RT-PCRで解析した結果、分化誘導7日目まではその発現が増強した。II型collagenやaggrecanの発現は分化とともに増強していくのと対照的に、caspinの発現はそれ以後は次第に減弱した。この時期はIX型collagenの発現が増加する肥大軟骨細胞への分化に相当する時期に一致しており、基質に血管を欠くことと関係していることが推測された。
以上の結果についての論文を執筆中であり、近々投稿予定である。