異物排出ポンプ外膜成分は新しい構造を持つチャンネルファミリーを形成するという発見

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11670275
• Research Institution: Tokai University
• Principal Investigator: 良原 栄策 東海大学, 医学部, 助教授 (70167063)
• Keywords: 多剤耐性 / 緑膿菌 / 薬剤排出ポンプ / OprM / tolC / α-ヘリックス / チャンネル / 膜トポロジー

Research Abstract

抗生物質は細菌感染症による死亡率を大幅に減少させ、人の平均寿命を大きく増加させるほどの効果をあげた。しかし近年各種抗生剤に耐性を示す多剤耐性菌が数多く出現し、抗生剤による治療が困難となる状況を迎えている。例えば、院内感染の主要原因菌である緑膿菌の多剤耐性は、抗生剤が菌内へ入り難くする外膜の存在と、菌内へ入った抗生剤を排出する系の協同作用の結果である。従って、多剤耐性菌に打ち勝つための手段や薬剤の開発には、これら排出ポンプの機能と構造の解明が必須である。
緑膿菌の主要な薬剤排出ポンプはMexA,B-OprMであり、OprMは外膜でチャンネルを作ると考えられていた。そこでOprMを精製し、リポソーム膜に再構成して活性を調べた。その結果、確かにOprMがチャンネルであると示された。今回、更にOprMのホモログである緑膿菌のOprJ及びOprNを精製し、活性を調べた。その結果これらタンパクもチャンネルを形成することが明らかとなった。一方、これらタンパクの二次構造を調べる目的で、CD測定を行ったところ、驚いたことにこれらタンパクの二次構造は共通してα-ヘリックスから成ることが明らかとなった。というのはこれまでに知られている外膜タンパクは例外なくβ-シートから成っていたからである。更に大腸菌のtolCタンパク(OprMのホモログ)も調べたところ、やはりα-ヘリックスから成ることが明らかとなった。すなわち外膜にα-ヘリックスから成る新しいチャンネルファミリーの存在が初めて明らかとなった。
次にこれらタンパク質のトポロジーの解明をを試みた。しかし従来の決定方法は煩雑でかなり欠点があったので、今回、Cys残基の部位特異的導入とプロテアーゼによるチャンネルタンパクの切断とを組み合わせた新しい決定方法の開発に取り組んだ。その結果、現在良好な結果が得られており、更にこの方法を洗練して行くつもりである。

Research Products

• [Publications] Kiyomi Okamoto: "Molecular cloning and characterization of the oprQ gene coding for outer membrane protein OprE3 of Psudomonas aeruginosa"Microbiol. Immunol.. 43(3). 297-301 (1999)
• [Publications] Monika Germ: "Interplay between the efflux pump and the outer membrane permeabilty in fluoresecent dye accumulation in Pseudomonas aeruginosa"Biochemical and Biophysical Reserch Communications. 261. 452-455 (1999)