1999 Fiscal Year Annual Research Report
フラビウィルスの非構造蛋白質NS3のもつATPase依存性ヘリカーゼに関する研究
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11670299
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
五十嵐 章 長崎大学, 熱帯医学研究所, 教授 (40029773)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
清水 博之 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 厚生技官 (90270644)
長谷部 太 長崎大学, 熱帯医学研究所, 助手 (20253693)
森田 公一 長崎大学, 熱帯医学研究所, 講師 (40182240)
只野 昌之 琉球大学, 医学部, 助教授 (80179712)
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| Keywords | JEV / RNA helicase / NS3 protein / ATPase |
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| Research Abstract |
日本脳炎ウイルス(JaOH0566株)の非構造蛋白質NS3のC末端領域457アミノ酸をコードする遺伝子領域を蛋白発現ベクター(pET-21b)に組み込み、N末端領域163アミノ酸を欠失するNS3蛋白質(NS3JEV-wild)を大腸菌で発現し、精製した。NS3JEV-wildはnucleoside triphosphatase(NTPase)活性及びRNAヘリケース活性が認められた。それぞれの酵素活性について至適反応条件について検討を行った。両酵素活性とも2価のイオン(MgCl_2またはMnCl_2)が必要であり、1価のイオン(K^+)及び2価のCa^<2+>の添加は逆に両酵素活性を抑制した。至適pHは約pH6.5、至適反応温度は40℃であった。Site-directed mutagenesis 法によりアミノ酸モチーフII(DExH)に変異を導入した、種々の変異体蛋白を作成しDExH配列のもつ酵素活性における役割について解析を行った。DExHの3番目及び4番目のアミノ酸置換はNTPase活性において低下が認められたものの、他のアミノ酸への置換が可能であった。1番目(アスパラギン酸)及び2番目(グルタミン酸)のアミノ酸をアラニンに置換した変異蛋白質では両酵素活性が完全に失活したことから、この1・2番目の配列が両酵素活性に必須な配列であることが推測された。来年度は、デングウイルス感染性cDNAクローンを用いて本酵素活性遺伝子領域に変異を導入した変異ウイルスまたはキメラウイルスを作成し、ウイルスレベルでの影響について解析する予定である。
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