ヒト免疫不全ウイルス粒子の試験管内成熟

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11670309
• Research Institution: The Kitasato Institute
• Principal Investigator: 森川 裕子 (社)北里研究所, 基礎研究所, 室長 (20191017)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 櫻木 小百合 (社)北里研究所, 基礎研究所, 研究員 (90312214)
• Keywords: HIV / 成熟 / プロセシング / 試験管内 / 粒子 / 感染性

Research Abstract

ヒト免疫不全ウイルス(HIV)のウイルス粒子はGag及びGag-Pol前駆体蛋白からなる未成熟型(非感染性)ウイルス粒子として出芽し、粒子内在のウイルスプロテアーゼ(PR)によるprocessingを受け、Gag蛋白がMA,CA,NC,p6蛋白に、Pol蛋白がPR,RT(逆転写酵素),IN(インテグラーゼ)蛋白に切断された成熟型(感染性)ウイルス粒子へ変換される。この粒子成熟を試験管内で再現する目的で、未成熟型HIV粒子(未切断のGag蛋白コアをもつ)に精製HIV PRを添加し、Gag蛋白のprocessing及び成熟型粒子への形態変換を昨年度は検討した。本年度は、この試験管内反応系におけるPol蛋白のprocessing、エンベロープ蛋白の保持、感染性獲得について検討した。1)Pol蛋白領域の切断ではRTはこのprocessingした粒子のコアから解離せず保持されていることが判明した。しかしながら、IN蛋白については特異的抗体がないため検討できなかった。2)粒子脂質二重膜の除去はその内部のGag蛋白切断に必須であるが、完全除去ではエンベロープ蛋白も除去されてしまう。そこで、エンベロープ蛋白を保持させたまま脂質二重膜を除去あるいは部分的に破壊する条件を見いだす目的で、低濃度の界面活性剤・超音波処理などを検討したところ、0.1%DigitoninあるいはTritonX-100処理で、エンベロープ蛋白を損失することなく粒子内のGag蛋白の切断が可能であることが判明した。3)感染性獲得について検討する目的で、まず、PR活性中心アミノ酸を不活性型に変異させ、かつ、エンベロープ蛋白領域をGFPに置換したcDNAクローンを作製した。これとVSVG蛋白発現plasmidをco-transfectionして得た未成熟型pseudotype粒子を用い、試験管内processingを行った。現在、このprocessingした粒子を239TあるいはHeLa細胞に感染させ、GFP発現量を測定している。

Research Products

• [Publications] Y.Morikawa,M.Shibuya,T.Goto,and K.Sano: "In vitro processing of human immunodeficiency virus type 1 Gag virus-like particle"Virology. 272. 366-374 (2000)
• [Publications] E.Haneda,T.Furuya,S.Asai,Y.Morikawa.and K.Ohtsuki: "Biochemical characterization of casein kinase II as a protein kinase responsible for stimulation of HIV-1 protease in vitro"Biochem.Bioph.Res.Commun.. 275. 434-439 (2000)
• [Publications] Y.Morikawa,D.Hockley M.Nermut,and I.Jones: "Roles of matrix, p2, and N-terminal myristoylation in human immunodeficiency virus type 1 Gag assembly"J.Virol.. 74. 16-23 (2000)
• [Publications] Y.Morikawa,A.Kinoshita,T.Goto,H.Tomoda,and K.Sano: "Membrane relocation but not tight binding of human immunodeficiency virus type 1 Gag particles myristoylated in Escherichia coli"Virology. (in press).