アリル特異的MVR-PCR迅速検出法を用いた法医分子遺伝学的解析法の確立

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11670411
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 山本 敏充 名古屋大学, 医学部, 助教授 (50260592)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 打樋 利英子 名古屋大学, 医学部, 助手 (20223571) ; 石井 晃 名古屋大学, 医学部, 助教授 (30252175) ; 勝又 義直 名古屋大学, 医学部, 教授 (30109326)
• Keywords: 蛍光標識dNTP / MVR-PCR / アリル特異的 / 集団遺伝学 / 法医学的応用 / 自動化

Research Abstract

ミニサテライトDNAの繰り返し単位内の変異をマツピングするMVR-PCR法は非常に高度な多型性をもち、また、フランキング領域の塩基置換多型部位(Hump1、Hf2、Hump2)を利用してアリル特異的MVR-PCR法によりアリルマッピングすることができる。従来は、放射性標識プローブを用いたオートラジオグラフィーにより検出されてきた。従って、技術的な問題が多く、利用できる施設が限られていた。今年度は昨年度に引き続き、MS32(D1S8)ローカスにおいて、多色蛍光標識dNTPをMVR-PCR反応時に加えて標識PCR産物を得る方法(インナーラベル法)を用いて、ABI PRISM377XLで検出し、GeneScanソフトウエアによりフラグメント解析する方法の精度及び感度を上げることを試みた。その結果、32Dプライマーを用いたdiploidマッピングでは、ほぼ40コード読むことができていたものが45以上ののコードを読むことが可能になった。また、アリルマッピングでは、Hp1、Hf2、Hp2プライマーを用いて、それぞれ約25、35、40以上マッピングしていたものが、H1C、Hf2-、H2C、H2Tプライマーいた場合は、リピート側から一番遠いフランキング多型部位のH1Cプライマーでも平均して40コード以上、他のプライマーではほぼ50コード読むことが可能になった。しかし、Hf2+とH1Gプライマーを用いた場合、20コードぐらいしかよむことができなかったので、Hf2+15CとH1G20Aという部分的ミスマッチプライマーを新たに設計してマッピングしたところ、平均して約35コード以上読むことが可能となった。オートラジオグラフィーによる原法にはやや劣るものの、これまでの迅速検出法に比べ、格段に多くのコードを読むことが可能となった。

Research Products

• [Publications] T.Yamamto: "The application of minisatellite variant repeat mapping by PCR(MVR-PCR)in a paternity case showing false exclusion due to STR mutation."J.Forensic Sci.. 46(in press). (2001)
• [Publications] 伊藤美春: "蛍光標識アリル特異的MVR-PCR迅速検出法によるアリル解析."DNA多型. 9(印刷中). (2001)