血管内皮及び平滑筋細胞におけるミオシン脱リン酸化酵素の生理機能解明

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11670687
• Research Institution: KYUSHU UNIVERSITY
• Principal Investigator: 平野 勝也 九州大学, 大学院・医学研究院, 講師 (80291516)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西村 淳二 九州大学, 大学院・医学研究院, 助教授 (90237727)
• Keywords: ミオシン / 脱リン酸化酵素 / 調節サブユニット / 血管平滑筋細胞 / 血管内皮細胞 / Ca^<2+>感受性 / 細胞増殖 / 細胞骨格

Research Abstract

血管緊張は平滑筋ミオシン軽鎖のリン酸化により調節され、このリン酸化のレベルはリン酸化酵素と脱リン酸化酵素のバランスで決定される。また、非筋細胞の運動やアクチン細胞骨格の形成もミオシン軽鎖のリン酸化により調節されている。最近、ミオシン脱リン酸化酵素がクローニングされたが、脱リン酸化酵素の生理的役割については不明な点があった。本研究では、まず、ブタ腎動脈から作製したTritonX-100スキンド標本を用いて、130kD調節サブユニットMYPT1による平滑筋収縮制御機構を明らかにした。MYPT1の種々の領域を欠損する変異体を細菌発現系を用いて作製し、Ca^<2+>が引き起こす収縮に及ぼす影響をブタ腎動脈スキンド標本を用いて解析した。血管標本をMYPT1^<1-633>(N末端1-633残基)で3時間前処置しておくと、Ca^<2+>収縮は増強され、収縮のCa^<2+>張力関係は左方に偏位した。この収縮増強作用は、触媒サブユニットとの結合領域を欠損しても認められたが、酸性アミノ酸集積領域(領域297-374)を欠損すると消失した。逆にMYPT1^<297-374>だけでも収縮増強作用を認めた。MYPT1^<1-374>は、300nM Ca^<2+>によるミオシン軽鎖リン酸化(22%)と収縮(最大収縮の35%)をそれぞれ36%と92%に増強し、一方、Ca^<2+>濃度を10^<-5>Mから0Mに下げた際に生じる弛緩反応を抑制した。すなわち、MYPT1のN末端領域は、脱リン酸化酵素を阻害することにより平滑筋収縮を増強し、この作用には酸性アミノ酸集積領域が重要であることが明かとなった。次いで、抗MYPT1抗体を用いた解析を行い、血管内皮細胞には平滑筋と同様のミオシン脱リン酸化酵素が発現することを明らかにした。内皮細胞は細胞間接触の形成により増殖を停止するが、蛍光免疫染色解析により、MYPT1は増殖停止に伴い細胞内局在が変化することが明かとなった。すなわち、増殖期にはMYPT1はストレスファイバーに添って分布するが、増殖を停止した細胞では細胞膜直下に分布した。さらに、内皮細胞からcDNAライブラリーを作製し、MYPT1をクローニングしたところ、内皮細胞には平滑筋と同一のMYPT1が発現することが明かとなった。平滑筋収縮のみならず、非筋細胞の細胞骨格も同様の機構で制御されていることが示唆された。

Research Products

• [Publications] Zhou YB,Hirano K,Sakihara C,Nishimura J,Kanaide H: "NH_2-terminal fragments of 130 kDa subunit of myosin phosphatase increases Ca^<2+> sensitivity of the porcine renal artery."Journal of Physiology. 516. 55-65 (1999)
• [Publications] Zhou YB,Nishimura J,Hirano K,Kanaide H: "The exogenously added small subunit of smooth muscle myosin phosphatase increases the Ca^<2+> of the contractile apparatus in the permeabilized porcine renal artery."Biochemical and Biophysical Research Communications. 254. 158-163 (1999)
• [Publications] Hirano M,Niiro N,Hirano K,Nishimura J,Hartshorne DJ,Kanaide H: "Expression, subcellular localization and cloning of the 130 kDa regulatory subunit of myosin phosphatase in porcine aortic endothelial cells."Biochemical and Biophysical Research Communications. 254. 490-496 (1999)
• [Publications] Hartshorne DJ,Hirano K: "Interactions of protein phosphatase type 1, with a focus on myosin phosphatase."Molecular and Cellular Biochemistry. 190. 79-84 (1999)
• [Publications] Arimura T,Suematsu N,Zhou YB,Nishimura J,Satoh S, et cl.: "Identification, characterization and functional analysis of heart-specific myosin light chain phosphatase small subunit"Journal of Biological Chemistry. (in press). (2001)
• [Publications] 平野勝也,金出英夫: "血管平滑筋の緊張制御に関する最新情報:Ca^<2+>感受性調節におけるミオシン脱リン酸化酵素の役割"医学のあゆみ. 191. 332-337 (1999)