エンドセリンを標的とした非ウイルス遺伝子治療法と血管病変、血管作動性に関する研究

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11670724
• Research Institution: Fukuoka University
• Principal Investigator: 野元 淳子 福岡大学, 医学部, 助手 (50299559)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 出石 宗仁 福岡大学, 医学部, 教授 (20131807) ; 自見 至郎 福岡大学, 医学部, 助手 (30226360) ; 朔 啓二郎 福岡大学, 医学部, 教授 (40183371) ; 野田 慶太 福岡大学, 医学部, 講師 (70289536) ; 熊谷 浩一郎 福岡大学, 医学部, 講師 (10248510)
• Keywords: エンドセリン(ET) / ET-B型受容体 / アンチセンスオリゴ / マイクロバブル法 / dpGapoE / リポフエクタミン法

Research Abstract

遺伝子導入による治療の可能性を探るため、血管攣縮や収縮作用に極めて重要であるエンドセリン(ET)を選択し、その受容体遺伝子を標的とした。まず、in vitroの研究として冠動脈内皮細胞を用い、そのET-B型受容体のアンチセンスオリゴを細胞へ導入し、その発現を抑制できるかを検討した。その遺伝子導入法としては、新しい方法である超音波とマイクロバブル法を用いた。また、従来の高濃度による導入法、リポフエクタミンによる導入法、および以前から取り組んでいた、合成ペプチドdiC18-Gly-apoE(dpGapoE)を使用した導入法を併せて行い比較検討した。dpGapoEは、LDL受容体と結合するアポ蛋白Eの129-169のペプチド合成物のN末端をパルミチック酸でアシル化し、さらにグルシンでアルキル化し、よりコンデンスさせ、LDL受容体に結合しやすくしたものである。
超音波とマイクロバブル法の最適条件は、超音波を1W、10% duty cycle、10secで使用し、アンチセンスの濃度は、900nM、マイクロバブル量は、50μlであった。この条件下でアンチセンスオリゴの導入率は、25±2%(そのうち生細胞へは、22±2%、すでに死亡した細胞へは、3±2%)であった。その導入率は、高濃度法(7.3±5%)より高率であったが、リポフエクタミン法(69±5%)よりも低率であった。DpGapoEを用いた場合、導入率40%程度だった。
超音波とマイクロバブル法の利点としては、リポフエクタミン法に比べて、操作が簡便で、短時間に終了すること、費用も高価なリポフエクタミンに比べ格安であることが挙げられるが、超音波による導入後に、フローサイトメーターにて陽性細胞のみを分別するなど、更なる改良で導入率の向上をはかる必要があると思われた。

Research Products

• [Publications] Liu K, Ou J, Saku K. et al.: "Efficient nuclear delivery of antisense oligodeoxynucleotides and selective inhibition of CETP expression by apo E peptide in a human CETP-stably transfected CHO cell line"Arterioscler Thromb Vasc Biol.. 19. 2207-2213 (1999)
• [Publications] Takao M., Zhang B., Fan P., Nomoto J., Saku K.: "The association among thoracic aortic atherosclerosis, coronary atherosclerosis and the function of high density lipoprotein"Atherosclerosis. 159. 407-416 (2001)