アデノ随伴ウィルスベクターを用いたSly病の遺伝子治療法の開発

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11670790
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 大橋 十也 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (60160595)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岩澤 京子 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助手 (10301524) ; 井田 博幸 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (90167255) ; 衛藤 義勝 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (50056909) ; 小林 博司 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助手 (90266619)
• Keywords: 遺伝子治療 / アデノ随伴ウイルス / MPS VII / Sly病

Research Abstract

平成11年度はβ-glucuronidaseを発現するrAAV-HBGを作製した。rAAV作製のは米国ジエンザイム社よりすでに供与を受けているシステムを利用した。発現ベクターであるpNTC3CMVにβ-glucuronidaseのcDNA組み込んだ後ヘルパープラスミドであるp5rep_CMVcapを293細胞(胎児腎臓由来細胞株)ヘカルシュウム・リン酸沈殿法によりトランスフェクションした。同時にtempreture sensitive mutantアデノウイルス(Ad5ts149)を感染させた。これを39度で培養し48時間後に細胞と培養液を回収した。回収後、硫酸セルロース・アフィニティークロマトグラフィーにてrAAV-HBGを濃縮した(平井幸彦ら、遺伝子治療の基礎技術、羊土社)。濃縮したrAAV-HBGをまずSly病マウスより培養した皮膚線維芽細胞に感染させた。3-4日後に細胞および培養上清中のβ-glucuronidaseの活性を測定したところ活性値の上昇をみた。β-glucuronidaseの活性を組織学的にα-naphtyl-ASBI-β-glucuronideを用いて染色したところ約60%の細胞にウイルスの感染を認めた。平成12年度はこれを用いてin vivoの実験を行う予定である。

Research Products

• [Publications] Ohashi T., Yokoo T., Eto Y., et al.: "Eduction of Lysosomal storage in Murine Mucoplysaccharidosis・・・"Blood. (in press). (2000)
• [Publications] Watabe K., Ohashi T., Eto Y., et al.: "Rescue of lesioned adult rat spinal motoneurons by・・・"Journal of Neuroscience Research. (in press). (2000)
• [Publications] Tsujino S., Kanazawa N., Ohashi T., et al.: "Three novel mutations (G27E, insAAC, R179X) in the ORNT1・・・"Arch of Neurol. (in press). (2000)
• [Publications] Yokoo T., Ohashi T., Eto Y., et al.: "Prophyaxis of Antibody-Induced Acute Glomerulonephritis・・・"Hum Gene Ther. 10. 2673-2678 (1999)
• [Publications] Ohashi T., Iizuka S., Eto Y., et al.: "Efficient and persistent expression of β-glucuronidase gene・・・"Eur J Haematol. 61(4). 235-239 (1998)