アデノ随伴ウイルスベクターを用いたsly病の遺伝子治療の開発

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11670790
• Research Institution: The Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 大橋 十也 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (60160595)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岩澤 京子 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助手 (10301524) ; 井田 博幸 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (90167255) ; 衛藤 義勝 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (50056909) ; 小林 博司 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助手 (90266619)
• Keywords: 遺伝子治療 / アデノ随伴ウイルス / MPS VII / Sly病

Research Abstract

平成12年度は、β-glucuronidaseを発現するrAVV-HBGを作製した。RAVV作製のは米国ジェンザイム社よりすでに供与を受けているシステムを利用した。発現ベクターであるpNTC3CMVにβ-glucuronidaseのcDNA組み込んだ後ヘルパープラスミドであるp5rep_CMVcapを293細胞(胎児腎臓由来細胞株)へカルシュウム・リン酸沈殿法によりトランスフェクションした。同時にtempreture sensitive mutantアデノウイルス(Ad5ts149)を感染させた。これを39度で培養し48時間後に細胞と培養液を回収した。回収後、硫酸セルロース・アフィニティクロマトグラフィーにてrAVV-HBGを濃縮した(平井幸彦ら、遺伝子治療の基礎技術、羊土社)。濃縮したrAVV-HBGをまずSly病マウスより培養した皮膚線維芽細胞に感染させた。3-4日後に細胞および培養上清中のβ-glucuronidaseの活性を測定したところ活性値の上昇をみた。β-glucuronidaseの活性を組織学的にα-naphtyl-ASBI-β-glucuronideを用いて染色したところ約60%の細胞にウイルスの感染を認めた。
次に精製したAAV-HBGをSly病のマウスの尾静脈より投与した。投与後、1週、2週、4週でマウスより各種臓器を摘出した。摘出した臓器におけるウイルス遺伝子の存在、酵素活性、病理学的検討を行った。肝臓、脾臓、心臓、などの各種臓器においてウイルス遺伝子の存在が確認されるとともに酵素活性の上昇が認められた。病理学的検討でも、ムコ多糖の蓄積の改善が認められた。
この効果は24週まで続いた。Sly病の一つの大きな罹患臓器である脳における活性の上昇は認められなかった。また病理学的にもムコ多糖の蓄積も改善されていなかった。今後の大きな課題であると思われた。

Research Products

• [Publications] Ohashi T.,Yokoo T.,lizuka S. et al: "Eduction of Lysosomal storage in Murine Mucoplysaccharidosis Type VII by Transplantation of Normal and Genetically Modified Macrophages."Blood. 95(11). 3631-3 (2000)
• [Publications] Eto Y.,Ohashi T.: "Gene therapy/cell therapy for lysosomal storage disease."J Inherited Metabo Dis. 23(3). 293-8 (2000)
• [Publications] Watabe K.,Ohashi T.,Sakamoto T. et al: "Rescue of lesioned adult rat spinal motoneurons by adenoviral gene transfer of glial cell line-derived neurotrophic factor."Journal of Neuroscience Research. 60. 511-9 (2000)
• [Publications] Futagawa Y.,Okamoto T.,Ohashi T.: "Efficiency of adenovirus-mediated gene Transfer into hepatocytes by liver asanguineous perfusion method."Res Exp Med (Berl). 199(5). 263-74 (2000)
• [Publications] Tsujino S.,Kanazawa N.,Ohashi T.: "Three novel mutations (G27E,insAAC,R179X) in the ORNT1 gene of Japanese patients with HHH syndrome."Arch of Neuro. 147(5). 625-31 (2000)