アミロイド形成阻害蛋白によるアルツハイマー病遺伝子治療薬開発の試み

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11670955
• Research Institution: Sapporo Medical University
• Principal Investigator: 続 佳代 札幌医科大学, 医学部, 助手 (60207420)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 深津 亮 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (10113614)
• Keywords: アルツハイマー病 / アミロイドβ蛋白 / アミロイド形成阻害蛋白 / 培養細胞 / APP遺伝子 / リポソーム法

Research Abstract

遺伝子導入技術を用いてアミロイド形成阻害蛋白(iAβ5:LPFFD)遺伝子を発現させてAβ凝集・沈着過程に与える影響を明らかにすることを目的に以下の予備的実験を行った。
1.アミロイド阻害蛋白iAβ5遺伝子並びに発現ベクターの作成:iAβ5を発現するDNAを合成し、発現ベクター(pTarget-T)に組み込みを行った。そのベクターをシークエンスして配列を確認した。
2.APP遺伝子、iAβ5遺伝子の培養細胞株への導入:iAβ5の発現ベクター(pTarget-T)をリポフェクトアミンを用いたリポソーム法にて各種培養ヒト筋細胞に導入を試みて遺伝子導入の諸条件を検討した。培養ヒト筋細胞(CCL-136)に対しては細胞毒性を示した為、導入に関する各種の条件に再度検討を加えた。また培養ヒト筋細胞(CRL-7767)にも遺伝子を導入した。遺伝子導入細胞をネオマイシン添加培地による選択培養に成功した。同様の方法で、野生型APP、変異型(Sweden型、British型)遺伝子の導入を試みた。野生型APPでは成功したが、変異型APP遺伝子では細胞毒性が強いため現在遺伝子の導入における条件を検討中である。
3.iAβ5に対するポリークローナル抗体の作製:合成ペプチドにkeyhole limpetを結合させた後、2羽のウサギに免疫してポリクローナル抗体を作製した。ELISA法にて十分とはいえないが抗体価の上昇が認められた。
4.病理学的検討:野生型APP遺伝子が過剰発現される細胞にクロロキンを非添加、添加して培養後、病理学的な変化を観察している。
現在安定した遺伝子導入細胞を大量に調整し、i)APPの各ドメインの抗体、抗Aβ抗体、抗iAβ5抗体を用いた免疫染色による各蛋白の局在、ii)細胞のライセートを調整し、上記抗体とのWestern blottingにより発現している蛋白の固定を試みている。

Research Products

• [Publications] Tsuzuki K, Fukatsu R, Yamaguchi H, Tateno M, et al.: "Transthyretin binds amyloidβpeptides, Aβ1-42 and Aβ1-40 to form complex in the autopsied human kidney-possible role of transthyretin for Aβsequestration-"Neuosience Letters. 281(印刷中). (2000)
• [Publications] 深津 亮、続 佳代、他: "APP並びにPS-1の局在とその発現に与えるTGF-β1の影響"Neuropathology. 19. 154 (1999)
• [Publications] 今井浩三、続 佳代、深津 亮、他: "Aβ沈着阻害(Sequestration)機構-ヒト部検腎におけるトランスサイレチンの役割に関する検討-"厚生省特定疾患 代謝系疾患調査研究班アミロイドーシス分科会 1998年度報告書. (印刷中). (1999)
• [Publications] 深津 亮、続 佳代、他: "APP並びにPS-1の局在とその発現、処理過程に与えるTGF-β1の影響"厚生省長寿科学総合研究老年病分野痴呆研究班 1998年度報告書. (印刷中). (1999)
• [Publications] 深津 亮、続 佳代: "IV 病因・病態 「臨床精神医学講座」 special issue 第9巻 アルツハイマー病"松下正明 総集編 三好好峰、小坂憲司 責任編集 中山書店 東京. 12 (2000)