2000 Fiscal Year Annual Research Report
膵β細胞に発現する脂質・アミノ酸反応性遺伝子の同定とその病態生理学的意義の解明
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11671109
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| Research Institution | Research Institute, International Medical Center of Japan |
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Principal Investigator |
安田 和基 国立国際医療センター, 研究所, 部長 (80311611)
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| Keywords | 膵β細胞 / 脂肪酸 / 遺伝子発現 / デファレンシャルディスプレイ / グルタミン酸脱水素酵素 |
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| Research Abstract |
マウス培養β細胞株であるβHC9細胞を用い、パルミチン酸を含む培養液及び含まない培養液で72時間培養した後、RNAzol試薬を用いてtotal RNAを回収した。GENOMYX社の蛍光ディファレンシャルディスプレイシステム(HIIEROGLYPH)用キットを使用し、アンカープライマーを用いてcDNA断片を合成、5'-arbituary primerと3'-蛍光アンカープライマーとでPCRを施行し増幅した。電気泳動および画像解析は、ベックマンコールスター社のFluoroDDを用いておこない、発現に差の見られたバンドを切りだして回収し、アダプター配列を利用してPCRで再増幅したのち、直接シークエンス法あるいはプラスミドサブクローニングにより、それぞれの塩基配列を決定した。増幅した断片の長さは100〜450bpであった。現在までに28クローンを切りだし、24クローンの塩基配列を決定した。既知クローンが14(うちミトコンドリアDNA由来が6クローン)、未知あるいはESTの報告のみのものが10クローンであった。現在、ノザン法あるいは定量RT-PCR法を用いて発現量の変化を確認するとともに、変化を認めたクローンの生理学的意義について検討中である。
またヒトにおいてグルタミン酸脱水素酵素異常による新生児高インスリン血症の症例を同定し、臨床像と比較しながらアミノ酸の膵β細胞への影響を解析した。
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