虚血性神経障害時に活性化されるプロテインカイネースCサブタイプの同定とその制御

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11671508
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 轟木 幸子 長崎大学, 医学部, 助手 (50039541)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 諸岡 浩明 長崎大学, 医学部・附属病院, 講師 (70230175)
• Keywords: 虚血 / プロテインカイネースC / トランスロケーション / ミトコンドリア / PC12細胞 / KCN

Research Abstract

PKCは虚血により活性化され、グルタメイトやアスパルテイトの遊離及び虚血性神経細胞障害に関与している可能性が大きい。
ラット副腎髄質由来PC12細胞を用い、細胞障害性とPKC活性について検討。
次に、PC12細胞に存在しているPKCサブタイプ(α,γ,δ,ε,ζ,λ)で、低酸素が各PKCサブタイプの細胞内動態に及ぼす時間・空間的影響を検討する。
1.PC12細胞を低酸素下(O_25%,CO_25%,N_290%、37℃)で3時間、6時間、12時間、24時間培養する。更に低酸素(O_21%,CO_25%,N_294%、37℃)下で1時間、3時間、6時間、12時間培養。
2.細胞障害性は、培養液中の乳酸脱水粗酵素(LDH)で測定。
3.膜、細胞質の各サブタイプPKCの蛋白発現はイムノブロット法にて測定。細胞を4℃,40000gで40分間遠心分離器して膜と細胞質に分離する。それぞれ一定の蛋白量を7.5%アクリルアミドゲルで電気泳動を行う。泳動したゲルをPVDF膜に転写しPKC抗体と一晩反応させる。次に2次抗体を作用させ洗浄後蛍光法でX線フィルムに露光させ現像後デンシトメーターを用いて目的のバンドを比較する。
酸素分圧を20%から5%に低下させた時の細胞障害性は、対照とほとんど差が見られなかった。しかし1%O_2では細胞の生存率は1時間から低下し始め、12時間で対照の70%まで低下した。
次に、低酸素(KCN,グルコース不含)がPKCサブタイプの細胞内動態に及ぼす時間的、空間的影響を検討した。低酸素刺激に対し、細胞質・細胞膜の各分画でのPKCサブタイプの蛋白量の変化は、PKCγが細胞膜で1時間から2時間まで上昇していた。
今後虚血における障害の標的であろうといわれているミトコンドリア分画をも含めて、細胞内動態を検討し、サブタイプ独自の生理機能の解析を行う。