新規眼内血管内皮成長因子のクローニングとその機能解析

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11671731
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 岩本 隆司 名古屋大学, 医学部, 助手 (60223426)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 伊藤 雅文 名古屋大学, 医学部, 助教授 (50184693) ; 北村 俊雄 東京大学, 医科学研究所, 客員助教授 (20282527) ; 三宅 養三 名古屋大学, 医学部, 教授 (30166136) ; 浜口 道成 名古屋大学, 医学部, 教授 (90135351)
• Keywords: Tie1 / TNFα / TGFβ / 血管内皮

Research Abstract

1 インターロイキン6レセプター/gp130およびTie1遺伝子のクローニング
マウス繊維芽細胞からRNAを抽出し、逆転写酵素によりcDNAを作成した。これをテンプレートにして、gp130特異的プライマーを用い、PCR法により増幅した。得られたDNA断片をシークエンスして、gp130細胞内領域を含むことを確認した。また、ヒト血管内皮細胞(HUVEC)よりRNAを抽出し、同様にcDNAを作成した。これをテンプレートにして、Tie1特異的プライマーによりPCR法を行い、得られたフラグメントをシークエンスし、細胞外領域を含むことを確認した。
2 インターロイキン6レセプター/gp130-Tie1キメラ遺伝子の作成と細胞への導入得られたフラグメントを制限酵素で処理し、発現ベクターpCDNA3に挿入し,gp130/Tic1キメラ発現プラスミドを構築した。このプラスミドをIL-3依存性プロB細胞Ba/F3にエレクトロポレーション法で導入し、現在その発現を検討中である。
3 血管内皮増殖因子TNFα,TGFβのシグナル伝達の抑制分子単離の試み
(1)TNFαのNIH3T3細胞に対するアポプトーシス誘導活性を指標として、TNFα耐性v-src-NIH細胞から作成したレトロウイルスライブラリーを用い、TNFα耐性クローンを複数得て、現在解析中である。
(2)TGFβのミンク肺がん細胞に対する増殖抑制活性を指標として、同じくレトロウイルスライブラリーを用い、TGFβ 耐性クローンををスクリーニング中である。
4 ヒト血管内皮細胞HUVECの温度感受性株の樹立
ヒト初代血管内皮培養細胞に温度感受性変異SV40T抗原を導入し、長期培養可能な安定株を得ることに成功した。この細胞株を今後の解析に使用していく予定である。

Research Products

• [Publications] Aye Aye Thunt: "Ras pathway is required for the activation of MMP-2 and for the invasion of Src-transformed 3Y1"Oncogene. 18. 6555-6563 (1999)
• [Publications] Miyazaki Kou: "Critical amino acid substitutions in the Src SH3 domain that convert c-Src to be oncogenic."Biochem.Bioph.Res.Co.. 263. 759-764 (1999)
• [Publications] Takahito Okuda: "Molecular cloning of macrophin, a human homologue of Porosophila kakapo with a close structure similarity to plectin and"Biochem.Bioph.Res.Co.. 264. 568-574 (1999)
• [Publications] Satoru Matsuda: "Molecular cloning and characterization of human MAWD,a novel protein containing WP-40 repeats frequently overexposed in breast cancer"Cancer Research. 60. 13-17 (2000)