ヘビ毒由来アポトーシス誘導因子アポキシンの分子機能及び生合成機構

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11672159
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 内藤 幹彦 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助教授 (00198011)
• Keywords: Apoxin / 蛇毒 / アポトーシス / アミノ酸オキシダーゼ

Research Abstract

出血性蛇毒であるガラガラ蛇の毒素からアポトーシス誘導因子Apoxin Iを精製した。生成した Apoxin I のN末アミノ酸配列の解析からApoxin IはLアミノ酸オキシダーゼと相同性が高いことが示され、実際精製Apoxin IがLアミノ酸オキシダー活性を持つことが明らかになった。CatalaseやTrolox等の活性酸素消去剤を用いた検討から、Apoxin IはLアミノ酸を酸化し、その結果生じた過酸化水素が細胞に傷害を与えアポトーシスを誘導することが明らかになった。精製Apoxin Iをリジルエンドペプチダーゼで消化して得られたペプチド断片のアミノ酸配列を決定し、この配列をもとに縮重プライマーを合成して、PCR法により蛇毒腺細胞のcDNAライブラリーからApoxin Iの全長cDNAをクローニングした。cDNA塩基配列の結果からApoxin Iはフラビン結合ドメインとADP結合ドメインを持ち、L-アミノ酸の酸化にFADを補酵素として必要とすることが示唆された。Apoxin IのcDNAを大腸菌に導入して発現を試みたが、L-アミノ酸オキシダーゼ活性のある蛋白質は生成しなかった。次にApoxin IのcDNAを真核細胞に導入して発現を試みたところ、組み替え蛋白質が細胞内に蓄積し、一部は培養液中に分泌されてくることがわかった。これらの組み替え蛋白質のL-アミノ酸オキシダーゼ活性を測定したところ、細胞内に蓄積しているApoxin Iは不活性であり、培養上清中に分泌されてきたApoxin IがL-アミノ酸オキシダーゼ活性を持つことがわかった。アポトーシス誘導活性についても同様であった。これらの結果から、Apoxin Iの活性は細胞内では抑制されており、分泌される過程で何らかの修飾を受けて活性化される可能性が考えられた。

Research Products

• [Publications] Dan, S.: "Activation of c-Abl tyrosine kinase requires caspase activation and is not involved in JNK/SAPK activation during apoptosis of human monocytic leukemia U937 cells"Oncogene. 18. 1277-1283 (1999)
• [Publications] Chen, Z.: "ASK1 mediates apoptotic cell death induced by genotoxic stress"Oncogene. 18. 173-180 (1999)
• [Publications] Mashima, T.: "Caspase-mediated cleavage of cytoskeletal actin plays a positive role in the process of morphological apoptosis"Oncogene. 18. 2423-2430 (1999)
• [Publications] Chen, Z.: "A human IAP-family gene, Apollon, expressed in human brain cancer cells"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 264. 847-854 (1999)
• [Publications] Hirotani, M.: "NH_2-terminal BH4 Domain of Bcl-2 Is Functional for Heterodimerization with Bax and Inhibition of Apoptosis"J. Biol. Chem.. 274. 20415-20420 (1999)