マクロファージ由来新規血管内皮細胞増殖抑制因子の精製と性状

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11672176
• Research Institution: Gifu Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 臼井 茂之 岐阜薬科大学, 薬学部, 講師 (40176665)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 平野 和行 岐阜薬科大学, 薬学部, 教授 (90057365)
• Keywords: 血管内皮細胞 / 増殖抑制因子 / P388D1 / カルボキシメチル化カードラン / cDNA

Research Abstract

抗腫瘍多糖であるカルボキシメチルカードラン(CMCD)の存在下にマウス白血病細胞P388D1を培養するとき、培養上清中にウシ動脈血管内皮細胞(BAE)に対する増殖抑制活性を見出した。この培養上清から、硫安分画、Hydroxyapatite、Q-Sepharose、Sepahcryl S-300、PBA30、PBE94の各種カラムクロマトグラフィーおよびC18カラムを用いたHPCLにて血管内皮細胞増殖抑制因子(EGSF)の精製を行った。HPLCによって分離された蛋白質は主に2種存在し、その分子量はSDS-PAGE分析の結果、いずれも約60kDaであった。この2種の蛋白質のEGSF活性を検討したが、いずれも失活していた。また、これらのN末端アミノ酸配列分析を行ったが、配列は明らかにはできなかった。これは恐らく、N末端アミノ酸がブロックされているためと考えられた。従って今後は、この2種の蛋白質をLys-Cによる蛋白質分解酵素処理し、得られたペプチド断片をHPLCにて分離後、これら断片のアミノ酸配列を分析する予定である。一方、EGSFのcDNAを単離する事を目的の1つとして、その他にCMCD刺激によりP388D1中でどの様なmRNAの転写が促進されるかをサブトラクションcDNA法により検討している。CMCD刺激したP388D1から調製したmRNAと未刺激のmRNAを用いてそれぞれcDNAを作製後、suppression subtractive hybridization(SSH)法によりサブトラクションcDNAライブラリーを作製した。現在、このライブラリーを解析中であるが、mitogen-activated protein kinase kinase 7、nucleoporin、ATPase-like vacuolar proton channel等を含む15種の遺伝子を同定し、CMCDによるP388D1の活性化機構を解明中である。