2000 Fiscal Year Annual Research Report
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11672286
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research |
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Principal Investigator |
加瀬 良一 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (20150203)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
新本 美智枝 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (20216237)
桜庭 均 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (60114493)
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| Keywords | ファブリー病 / α-ガラクトシダーゼ / リソソーム / 酵素補充療法 |
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| Research Abstract |
1、改変体酵母によるα-ガラクトシダーゼの大量発現と精製法の確立
酵母(Pichia pastoris)遺伝子相同組み換えベクター(アルコール酸化酵素プロモーターを持つ分泌型)に、α-ガラクトシダーゼcDNAの挿入をおこなった。このベクターを用いた遺伝子相同組み替え・クローニングをおこない、α-ガラクトシダーゼcDNAを染色体上にもつ酵母株を得た。α-ガラクトシダーゼの発現には、酵母のメタノール資化性を利用し、発現酵素の精製には、2段階のカラム・クロマトグラフィーからなる簡便かつ有効な方法を確立した。さらに組み換え体酵母株の大量培養をおこない、精製酵素標品のストック作製をおこなった。
2、細胞による発現α-ガラクトシダーゼ取り込みの検討
Pichia属酵母の糖鎖の特徴は、ホスホ・マンナン骨格の含量が高いことである。得られたα-ガラクトシダーゼの糖鎖部分に対し、α-マンノシダーゼによるトリミングをおこない、ホスホ・マンナン部分(リン酸化マンノース)の露出を試みた。次に、糖鎖改変による、細胞内への取り込み効率を検討するため、ファブリー病患者由来の培養ヒフ線維芽細胞(酵素欠損)を用い、発現α-ガラクトシダーゼの添加実験をおこなった。
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Research Products
(5 results)
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[Publications] Utsmi,K.: "Urinary excretion of the vitronectin receptor (integrinα_Vβ_3) in patients with non-insulin dependent diabetes"Clin.Exper.Nephr.. 1. 41-45 (1999)
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[Publications] Utsumi,K.: "Urinary excretion of the vitronectin receptor(integrinα_vβ_3) in patients of Fabry disease"Clin.Chim.Acta. 279. 55-68 (1999)
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[Publications] Sakuraba,H.: "Gm_2 Gangliosidosis AB variant : Clinical and biochemical studies of a Japanese patient"Neurology. 52. 372-377 (1999)
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[Publications] Utsumi,K.: "Fabry disease in patients receiving maintenance dialysis"Clin.Exp.Nephrol.. 4. 49-51 (2000)
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[Publications] Kase,R.: "Characterization of two α-galactosidase mutants (Q279E and R301Q) found in an atypical variant of Fabry disease"Biochim.Biophys.Acta. 1501. 227-235 (2000)
