Granzyme活性と遺伝子制御の検討とその臨床的意義に関する研究

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11672298
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 寮 隆吉 神戸大学, 医学部, 教授 (00159237)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 掘江 修 神戸大学, 医学部, 助手 (50304118)
• Keywords: granzymeB / CD8+リンパ球 / IL-12 / GST融合タンパクシステム / apoptosis / herpesvirus saimiri / limiting dilution / minor histocompatibility antigen

Research Abstract

(1)Granzyme B(grB)mRNAの発現をRT-PCRで検討しNK細胞株(YT-u)とCD8+Tリンパ球に発現していることを明らかにした。Cytokineの影響を検討してNK細胞のgrB mRNAはIL12によって最も強く制御されていることを見出した。さらにYT-uはIL2とIL12の併用によってgrB mRNAが相加的に上昇した。これはYT-uには正常とは異なるcytokine感受性があることを示していると考えられる所見を得た。
(2)GrBの生理的役割を明らかにするために大腸菌発現系CST融合タンパクシステムを用いてrecombinant grBの作成を行った。正常のgrBよりやや分子量の大きなrecombinant grBが得られた。ただこのrecombinant蛋白は細胞をapoptosisさせる活性がなかった。そこでこの蛋白を使ってgrBのELISA測定法に必要なmonoclonal抗体の作成に取り組んでいる。現在activeなgrBを得るために酵母菌を用いた発現系を用いてrecombinant grBをを作成している。
(3)GrBのapoptosis作用を定量化するためにCMK細胞を使ってapoptosisの定量化を試みた。ヒストン結合断片化DNA検出によってapoptosisの定量が可能であることを明らかにした。ただこの方法は標的細胞だけのapoptosisを見るのは不適切であり、標的細胞をannexinVで標識して細胞膜透過性の変化をflow cytometryで検出する方法でapoptosisの定量化の実験を進めている。
(4)臓器特異性あるいはvirus特異性のCTL中のgrB mRNAの動きを検討するためには長期間培養できるCTL cloneの樹立が必要である。そこでHerpesvirus saimiriを使って正常人のT細胞のclone化を試みた。約半年viableなCTL cloneを樹立しlimiting dilution法でCD8+CTL cloneを樹立した。またこのCTL cloneはgrBとperforin mRNAを発現していることを確認した。この方法を使って骨髄移植後GVHDを発病した患者から臓器特異性のCTLcloneを樹立し、minor histocompatibility antigenを同定中である。

Research Products

• [Publications] 富和洋子、寮隆吉: "Herpesvirus saimiri を用いた細胞障害性Tリンパ球クロ-ン樹立に関する研究"神戸大学医学部保健学科検査技術科学専攻卒業論文集. 1. 77-80 (2000)
• [Publications] 濱田敬子、寮隆吉: "各種血球のGranzyme B mRNA発現とそれに対するcytokineの影響"神戸大学医学部保健学科検査技術科学専攻卒業研究論文集. 1. 81-84 (2000)