Granzyme活性と遺伝子制御の検討とその臨床的意義に関する研究

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11672298
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 寮 隆吉 神戸大学, 医学部, 教授 (00159237)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 堀江 修 神戸大学, 医学部, 助手 (50304118)
• Keywords: granzyme B / HLA / ELISA / perforin / TNFα / Herpesvirus saimiri / CTL / minor histocompatibility antigen

Research Abstract

(1)Perforinの発現をRT-PCRで検討しNK細胞株(YT-u)とCD8+Tリンパ球に発現していることを明らかにした。さらに生理的役割を明らかにするために大腸菌発現系GST融合タンパクシステムおよびPETシステムを用いてrecombinant perforinの作成を行った。GST融合タンパクシステムでrecombinant perforinは発現したが、現在はその機能を解析中である。さらにactiveなperforinを得るために昆虫細胞発現系にてrecombinant perforinを作成中である。
(2)Recombinant granzymeBを抗原としてハイブリドーマ作製法に従いmonoclonal抗体の作成を行った。抗原認識部位が異なる3種類の抗体が得られた。この抗体を一次抗体とするgrB one step ELISAを確立した。その中でk6866と名付けたmonoclonal抗体が400pg/ml〜400ng/mlのgrBの測定に適していた。この感度は酵素学的測定法の2000倍鋭敏であった。生体での異常な免疫反応の早期診断に血中grBの測定は有用と考えられるので、さらに感度を上げて各種疾患のgrBの測定を進めている。
(3)In vitroで作成したCTLの性状が骨髄移植後のGVHDの重症度を予測できるかどうかを知るため、そのCTLの細胞傷害性について検討した。HLA適合およびHLA不適合の組み合わせを作り、それぞれCD4+CTLとCD8+CTLを得た。細胞傷害性をTNFα産生能とgranzymeB mRNAの発現より検討した結果、TNFα産生能はHLA適合例のCD4+CTLに増強が見られた。GranzymeBの発現はHLA適合例ではCD4+CTLに増強が見られ、HLA不適合例ではCD8+CTLに増強が見られた。今後症例を重ねCTLの細胞傷害性の意義を明らかにする予定である。

Research Products

• [Publications] Ryukichi Ryo, et al.: "Treatment of post-transfusion grafe-versus-host disease with nafmostat mesilate, a serine protease inhibitor"Vox Sanguinis. 76・4. 241-246 (1999)
• [Publications] Katsuyasu Saigo, et al.: "Therapeutic Strategy for post-transfusion grafe-vs.-host disease"International Journal of Hematology. 69・3. 147-151 (1999)
• [Publications] Osamu Horie et al.: "Establishment of a lymphocyte clone expressing granzyme B and perforin mRNAS immortalized with Herpesvirus saimiri"Bulletin of Health Science Kobe. 16. 39-44 (2000)
• [Publications] Osamu Horie et al.: "Cytokine dependency of granzyme B mRNA expression in natural killer leukemic cell line, YT-u."Bulletin of Health Science Kobe. 16. 57-62 (2000)