膜結合型HGF活性化阻害因子のプロセッシングによる分子構造変化と機能調節の解明

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11680603
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 伝田 公紀 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 助手 (50212064)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 下村 猛 三菱化学, 研究開発本部・医薬基盤研究所, 主任研究員
• Keywords: 肝細胞増殖因子(HGF) / 血液凝固線溶系 / セリンプロテアーゼカスケード / Kunitz型インヒビター / セクレターゼ

Research Abstract

HGF(HGF;hepatocyte growth factor)の局所的活性発現を担うセリンプロテアーゼ(HGF activator)の2つの阻害因子(HAI)が近年申請者らにより単離され,膜結合性のKunitz型セリンプロテアーゼインヒビターであることが明らかになった。本研究ではHGFの活性制御を担うHAIのin vivoにおける役割を解明することを目的として機能解析を行い現在までに以下の知見が得られた。
1 HAIのプロセッシング機構を明らかにするため,HAIの発現細胞における蛋白質局在様式を解析した。(1)HAIに対して特異的なマウスモノクローナル抗体を作製し,発現細胞中におけるHAIの局在様式の変化・分泌型/膜結合型の量比変化を調べた。(2)HAIのC末側の膜結合領域欠失体に相当するcDNAをGFPベクターに組み込み動物細胞中で発現させ,共焦点レーザー顕微鏡を用いてHAI全長が発現した場合とin vivoでの蛋白質局在を比較検討した。その結果,2つのHAI共に膜結合型分子は膜表在的分布を呈する一方,分泌型分子は細胞質内に存在した(submitted)。
2 特定の機能ドメインが特定の機能発現に必須であるか調べるためHAIに存在する機能ドメインの各所が欠失した膜結合型ならびに分泌型の変異蛋白を発現させ個々の変異体について1と同等の手法で解析した。その結果,第1Kunitzドメインを含む膜型分子の細胞表層上でのHGF activatorとの相互作用が認められた。細胞内蛋白輸送の特異的阻害剤の実験系への導入も含め,以上の結果が機能ドメインの欠損による影響なのか現在解析中である。
3 膜結合型から分泌型が生成するプロセッシング機構を明らかにすることはHAIの生理的役割を理解する上で重要である。そこで,HAIの分泌酵素(secretase)を検索することを目的として酵母Two Hybrid法によりHAIと相互作用する機能分子を検索した。その結果,細胞骨格蛋白質等の若干の相互作用分子がHAIとin vivoで強く結合することが明らかとなった。これらのうちの一つは,アポトーシスに対し抑制的に作用すると考えられる蛋白質だった(unpublished results)。
今後も小胞体で生合成され細胞表層へ移行した膜結合型分子からの分泌型への変換ならびにそれ以降のプロセッシングにおけるHAIの機能制御に対する分子構造変化のメカニズムを解明することを目的として引き続き研究を進めていきたいと考えている。

Research Products

• [Publications] Shimomura,T. et al.: "HGF activator inhibitor, a novel Kunitz-type serine protease inhibitor."J.Biol.Chem.. 272. 6370-6378 (1997)
• [Publications] Kawaguchi,T. et al.: "Purification and cloning of hepatocyte growth factor activator inhibitor type 2, a novel Kunitz type serine protease inhibitor."J.Biol.Chem.. 272. 27558-27564 (1997)
• [Publications] Kataoka,H. et al.: "Evaluation of hepatocyte growth factor activator inhibitor expression in normal and malignant colon mucosa."Cancer Lett.. 128. 219-227 (1998)
• [Publications] Qin,L. et al.: "Functional characterization of Kunitz domains in hepatocyte growth factor activator inhibitor type 2."FEBS Lett.. 436. 111-114 (1998)
• [Publications] Shimomura,T. et al.: "Multiple sites of proteolytic cleavage to release soluble forms of hepatocyte growth factor activator inhibitor type 1 from a transmembrane form."J.Biochem.. 126. 821-828 (1999)
• [Publications] Takata,H. et al.: "An Hrs binding protein with a Src homology 3 domain involved in intracellular degradation of growth factors and their receptors."Genes Cells. 5. 57-69 (2000)
• [Publications] 山本,田矢 共編(分担): "BioScience用語ライブラリー:癌遺伝子・癌抑制遺伝子"羊土社. (1997)
• [Publications] 伝田公紀,喜多村直実: "肝細胞の活性化を制御するプロテアーゼ"共立出版社. (1997)