分子生物学的手法を用いた神経系特異的糖鎖の機能解析

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11680604
• Research Institution: KYOTO UNIVERSITY
• Principal Investigator: 岡 昌吾 京都大学, 薬学研究科, 助教授 (60233300)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川嵜 敏祐 京都大学, 薬学研究科, 教授 (50025706)
• Keywords: HNK-1糖鎖抗原 / グルクロン酸転移酵素 / 細胞接着分子 / 遺伝子欠損マウス / L1 / 硫酸基転移酵素

Research Abstract

単クローン抗体HNK-1により認識されるHNK-1糖鎖抗原は、昆虫から哺乳動物まで広く神経系組織に分布し、しかも時期特異的に発現する抗原である。申請者らは既に、HNK-1糖鎖抗原の生合成に関与するグルクロン酸転移酵素(GlcAT-P)および硫酸基転移酵素のcDNAのクローニングに成功している。そこで得られたHNK-1糖鎖生合成に関わる酵素cDNAを用いて、本研究により以下のような結果を得た。
1)HNK-1糖鎖抗原の生合成に関与する酵素遺伝子の神経系における発現解析。
GlcAT-Pおよび、硫酸基転移酵素について、脳内でのmRNAの発現をin situハイブリダイゼーション法により調べた結果、GlcAT-Pの発現はHNK-1糖鎖の発現とよく一致していたが、硫酸基転移酵素は脳に全体的に発現することが明らかとなった。従ってHNK-1糖鎖の特徴的な発現はGlcAT-Pによって制御されていると考えられた。
2)細胞レベルでのHNK-1糖鎖抗原の機能解析。
GlcAT-Pを含む安定形質導入細胞(C6グリオーマ細胞)を作成し、HNK-1糖鎖の突起伸長における役割を解析した結果、HNK-1糖鎖はC6グリオーマ細胞表面に存在する細胞接着分子NCAMやL1に特徴的に発現しており、特にL1分子上に発現したHNK-1糖鎖が細胞の突起伸長に重要であることが明らかとなった。
3)GlcAT-P遺伝子の欠損したノックアウトマウス作成及びその解析。
GlcAT-P遺伝子のヘテロ変異マウスの交配によりホモ変異マウスを得、本酵素の欠損をサザンおよびノーザン解析法により、また大部分のHNK-1糖鎖の欠損をウエスタンブロット解析法により確認した。

Research Products

• [Publications] K.Ohtsubo et al.: "Studies on the Structure-Function Relationship of the HNK-1 Associated Glucuronyltransferase, GlcAT-P, by Computer Modeling and Site Directed Mutagenesis."J.Biochem.. 128(2). 283-291 (2000)
• [Publications] Y.Mitsumoto et al.: "Cloning and Chromosomal Mapping of Human Glucuronyltransferase Involved in Biosynthesis of the HNK-1 Carbohydrate Epitope."Genomics. 65(2). 166-173 (2000)
• [Publications] 岡昌吾 ら: "神経系における糖鎖の役割糖鎖リモデリングによるHNK-1糖鎖の解析を中心に"細胞工学. 20(2). 187-192 (2001)