2000 Fiscal Year Annual Research Report

ピリドキサール酵素のプロトン移動機構の基礎的研究

Research Project

Project/Area Number	11680641
Research Institution	Osaka Medical College
Principal Investigator	林秀行大阪医科大学, 医学部, 助教授 (00183913)
Keywords	pK_a / 解離基 / 歪み / プロトン / コンフォメーション / 遷移状態 / 活性化エネルギー / ピリドキサールリン酸
Research Abstract	本年度はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AAT)と芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ(ART)について触媒過程におけるプロトン移動機構を詳細に調べた。AATにおいてはPLP-Lys258シッフ塩基の塩基性が反応の進行に伴って変化することが触媒作用に重要な役割を有する。部位特異的変位とX線結晶解析により調べた結果,シッフ塩基の塩基性の変化は従来考えられた基質カルボキシル基の静電的効果はわずかであり,大部分が酵素のコンフォメーション変化に伴うシッフ塩基の捩れの解消によってもたらされていることが判明した。さらに,2つのドメイン間に位置するAsn194がこのコンフォメーション変化をシッフ塩基に伝えていたことが判明し,このクラスの酵素で強く保存されていた同残基の役割が初めて明らかになった。この成果をもとに,ARTの反応機構を調べた。ARTにおいては負荷電がより少ない芳香族アミノ酸基質の方が酸性アミノ酸基質よりもシッフ塩基のpK_aを高めている機構が謎であったが,X線結晶解析で得られた図を詳細に検討すると,芳香族基質の芳香環がPLPの近傍に位置しているTrp140を圧迫し,そのためにPLPのピリジン環の変位を通じてシッフ塩基の捩れを解消し,大きなpK_aの上昇をもたらすことが判明した。以上のことは,酵素内部の解離基のpK_aが,静電的相互作用のみならず解離基自体やその解離基を取り巻くタンパク質のコンフォメーション変化によって説明されることを示している。さらにプロトン数座標軸を取った三次元的なエネルギー準位の考察を行うことで,コンフォメーション等の歪みのエネルギーが酵素触媒の本質であり,解離基のpK_aはそれに派生した二次的なものであることを明らかにした。このようにして,酵素内部の解離基の解離現象・プロトン移動についての本質的理解を行うための方法論を提唱した。これは今後の酵素触媒研究において重要な意義を有すると考えられる。

Research Products
(7 results)

All Other

All Publications (7 results)

[Publications] Ikushiro,H.: "A water-soluble homodimeric serine palmitoyltransferase fromSphingomonas paucimobilis EY2395T strain : purification, characterization, cloning, and overproduction."J.Biol.Chem.. 276(in press). (2001)
[Publications] Matharu,A.: "Contributions of the substratebinding arginine residues to maleateinduced closure of the active site of Escherichia coli aspartate aminotransferase."Eur.J.Biochem.. 269(in press). (2001)
[Publications] Mizuguchi,H.: "Strain is more important than electrostatic interaction in controlling the Kp_a of the catalytic group in aspartate aminotransferase."Biochemistry. 40(2). 353-360 (2001)
[Publications] Islam,M.M.: "The substrate activation process in the catalytic reaction of Escherichia coli aromatic amino acid aminotransferase."Biochemistry. 39(50). 15418-15428 (2000)
[Publications] Kagamiyama,H.: "Escherichia coli branched-chain amino acid aminotransferase."Meth.Enzymol.. 324. 103-113 (2000)
[Publications] 林秀行: "酵素反応の本質へ-エネルギー準位の多次元的理解"蛋白質核酸酵素. 46(1). 36-44 (2001)
[Publications] 林秀行: "酵素触媒の原理(バイオサイエンスの新世紀第3巻「タンパク質の分子設計」後藤祐児・谷澤克行編),pp.50-64."共立出版. 201 (2001)

2000 Fiscal Year Annual Research Report

ピリドキサール酵素のプロトン移動機構の基礎的研究

Principal Investigator

林 秀行 大阪医科大学, 医学部, 助教授 (00183913)

Research Products

[Publications] Ikushiro,H.: "A water-soluble homodimeric serine palmitoyltransferase fromSphingomonas paucimobilis EY2395T strain : purification, characterization, cloning, and overproduction."J.Biol.Chem.. 276(in press). (2001)

[Publications] Matharu,A.: "Contributions of the substratebinding arginine residues to maleateinduced closure of the active site of Escherichia coli aspartate aminotransferase."Eur.J.Biochem.. 269(in press). (2001)

[Publications] Mizuguchi,H.: "Strain is more important than electrostatic interaction in controlling the Kp_a of the catalytic group in aspartate aminotransferase."Biochemistry. 40(2). 353-360 (2001)

[Publications] Islam,M.M.: "The substrate activation process in the catalytic reaction of Escherichia coli aromatic amino acid aminotransferase."Biochemistry. 39(50). 15418-15428 (2000)

[Publications] Kagamiyama,H.: "Escherichia coli branched-chain amino acid aminotransferase."Meth.Enzymol.. 324. 103-113 (2000)

[Publications] 林秀行: "酵素反応の本質へ-エネルギー準位の多次元的理解"蛋白質核酸酵素. 46(1). 36-44 (2001)

[Publications] 林秀行: "酵素触媒の原理(バイオサイエンスの新世紀 第3巻 「タンパク質の分子設計」後藤祐児・谷澤克行編),pp.50-64."共立出版. 201 (2001)

林秀行大阪医科大学, 医学部, 助教授 (00183913)

[Publications] 林秀行: "酵素触媒の原理(バイオサイエンスの新世紀第3巻「タンパク質の分子設計」後藤祐児・谷澤克行編),pp.50-64."共立出版. 201 (2001)