2000 Fiscal Year Annual Research Report
蛍光相互相関分光法による三重鎖DNA分子間相互作用の解析
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11680651
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| Research Institution | HOKKAIDO UNIVERSITY |
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Principal Investigator |
金城 政孝 北海道大学, 電子科学研究所, 助教授 (70177971)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西村 吾朗 北海道大学, 電子科学研究所, 助手 (30218193)
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| Keywords | Triplex / 三重鎖DNA / 蛍光測定 / 蛍光色素 / 蛍光相関分光法 / ハイブリダイゼーション / ゆらぎ |
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| Research Abstract |
本研究の目的は分子間相互作用を高感度に検出する蛍光相互相関分光法(Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy、FCCS)を用い、蛍光標識二重鎖DNA+蛍光標識オリゴDNAを対象にして、三重鎖DNA生成時の分子間相互作用の特徴を明らかにすることである。これまで我々の開発してきた蛍光相関分光法(FCS)ではその検出は分子の大きさ、分子を球としたときのその半径、そのため2重鎖+1重鎖のように分子量変化が2倍程度の時はFCSの測定パラメータである拡散時間の変化は1.2倍の相違しか検出が期待できない。そこで、発光波長の異なる2種類の蛍光分子の揺らぎの「同時性」を解析することに基づくFCCSを用いて、分子が結合して同時に動く時の、同時に揺らいでいる信号を検出し、それを解析することで三重鎖形成解析のための定量的手法を確立し、安定化機構を明らかにしようとするものである。
FCCSでは2種類の蛍光色素を用いて、それぞれ別のオリゴDNA鎖に結合させて、その蛍光強度の揺らぎを測定する。これまでにRhodamine GreenとCy5の組み合わせが最適であることが分かった。また、相補的な20塩基対、相補的な40塩基対並びに、相補的でない20塩基と40塩基の組み合わせで、それぞれFCCSの測定を行った。その結果、相補的な20塩基並びに40塩基の組み合わせにおいては明確な相互相関の信号が得られ、それぞれ2重鎖の形成率が43%と50%であること、また一方、相補的でない組み合わせでは信号が得られなかった。
一方、DNA結合蛋白質である、Fos、Junとその認識DNA配列の組み合わせを用いたモデル実験では、色素と蛋白もしくはDNAの組み合わせによっては凝集体ができたりして、条件によっては測定が不可能な事があることが分かった。
現在これらの結果をもとに3重鎖形成の過程をFCCSを用いて測定解析を進めている。
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[Publications] Nomura, Y.: "Monitoring of in vivo and in vitro translation of green fluorescence protein and its fusion proteins by fluorescence correlation spectroscopy."Cytometry.. 44. (2001)
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[Publications] Yoshida, N: "Microenvironment of endosomal aqueous phase investigated by the mobility of microparticles using fluorescence correlation spectroscopy."Biochem.Biophys.Res.Comm.. 280. 312-318 (2001)
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[Publications] Yoshida, N: "Fluorescence correlation spectroscopy : A new tool for probing the microenvironment of the internal space of organelles."Single Molecules.. 1. 279-283 (2001)
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[Publications] Terada, S: "Oligomeric tubulin in large transporting complex is transported via kinesin in squid giant axons."Cell. 103. 141-155 (2000)
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[Publications] 金城政孝: "ConfoCor : 蛍光相関顕微鏡"細胞. 38. 254-258 (2000)
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[Publications] Pack, C-G: "Effect of electrostatic interaction on the binding of charged substrate to GroEL studies by high sensitive fluoresccence correlation spectroscopy."Biochem Biophysi Res Comm.. 267. 300-304 (2000)
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[Publications] 宮脇敦史: "GFPとバイオイメージング"羊土社. 276 (2000)
