2000 Fiscal Year Annual Research Report
哺乳類細胞の細胞表面に発現する70kD熱ショック蛋白質の分子クローニング
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11680703
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
鳥越 俊彦 札幌医科大学, 医学部, 講師 (20301400)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 昇志 札幌医科大学, 医学部, 教授 (50158937)
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| Keywords | 分子シャペロン / 熱ショック蛋白質 / HSP70 / Lamin B1 / Daudi細胞 / 発現クローニング / 腫瘍抗原 / 腫瘍免疫 |
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| Research Abstract |
細胞表面に発現する70kD熱ショック蛋白質(HSP70)の遺伝子をクローニングするために,cDNAライブラリーを作製し,以下の方法でクローニングを行っている.
(1)蛋白質アミノ酸配列の決定
抗体NT22は細胞表面に発現するHSP70相同分子を認識する.アフィニティークロマトグラフィーによってNT22抗原を精製し,限定分解産物のアミノ酸配列を決定した結果,Lamin B1蛋白質と同じ配列が得られた.リコンビナントLamin B1蛋白質を作製したところ,NT22抗体はこの蛋白質と反応した.しかし,ポリクロナル抗Lamin B1抗体は細胞表面のNT22抗原と反応しなかったことから,細胞表面のHSP70相同分子はLamin B1蛋白質ではないと結論した.
(2)PCRクローニング法
細胞表面に発現するHSP70を認識する抗体NT22のエピトープをmappingし,HSC73蛋白質のアミノ酸345-373の領域を認識することを明らかにした.この領域をコードするDNA配列をもとにしてdegenerated primerを作製し,PCRクローニングを試みた結果,PCR産物が1種類得られた.塩基配列を決定したところ,これまでに報告のない未知の遺伝子であることが判明した.しかし,この遺伝子にはHSP70相同配列やNT22エピトープ相同配列が含まれておらず,細胞表面のHSP70相同分子である可能性は低いと判断された.
(3)発現クローニング法
Daudi細胞から,発現クローニングのために2種類のライブラリーを作製した.1つは,通常の発現クローニングのためにpcDNAI/amp vectorに挿入したライブラリー,他の1つはsignal sequence trap法のためにpDisplay vectorに挿入したライブラリーである.現在,これらのライブラリーを用いて発現クローニングを行っている.また,Hela細胞のretrovirus cDNAライブラリーを得た.これをマウスMeth A細胞に感染させ,NT22発現細胞をセルソーターで回収する方法も行なっている.
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[Publications] Kanki,K.,T.Torigoe,I.Hirai,Y.Tamura,A.Yagihashi,N.Sato. et al.: "Molecular cloning of rat NK target structure-the possibility of CD44 involvement in NK cell-mediated lysis."Microbiol.Immunol.. 44. 1051-1061 (2000)
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[Publications] Maeda,A.,H.Ohguro,Y.Nabeta,T.Torigoe,Y.Kuroki,N.Sato. et al.: "Identification of human antitumor cytotoxic T lymphocytes epitopes of recoverin, a cancer-associate retinopathy antigen, possibly related with a better prognosis in a paraneoplastic syndrome."Eur.J.Immunol.. 31. 563-572 (2001)
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[Publications] Nagata,M.,T.Akazawa,Y.Tamura,T.Torigoe,N.Sato. et al.: "The expression of a novel natural killer inhibitory molecule, Cho-1, on the chorionic cytotrophoblast cells of successful pregnancy, but not of spontaneous abortion."Pathol.Int.. 50. 824-831 (2000)
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[Publications] Sato,N.,Y.Nabeta,H.Kondo,T.Torigoe,H.Ikeda et al.: "Human CD8 and CD4 T cell epitopes of epithelial cancer antigens."Cancer Chemother Pharmacol.. 46. 86-90 (2000)
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[Publications] Fujita,T.,Y.Matsumoto,I.Hirai,T.Torigoe,K.Jimbow,N.Sato. et al.: "Immunosuppressive effect on T cell activation by interleukin-16-cDNA-transfected human squamous cell line."Cell Immunol.. 202. 54-60 (2000)
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[Publications] 鳥越俊彦,一戸崇,佐藤昇志: "分子シャペロンによる細胞機能制御,分子シャペロンと病態:抗原ペプチド"シュプリンガーフェアラーク東京出版(印刷中). (2001)
