無血清培養系を用いた筋分化に関わるプロテアーゼとインヒビターの同定

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11680705
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 安光 英太郎 横浜市立大学, 木原生物学研究所, 助教授 (10182346)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宮崎 香 横浜市立大学, 木原生物学研究所, 教授 (70112068)
• Keywords: serum-tree culture / myogenesis / myoblasts / secretory protease / protease inhibitor / C2C12 cells / zymography / metalloprotease

Research Abstract

[背景]筋分化過程でプロテアーゼが重要な働きをしているという結果が、インヒビターなどを使った培養実験系で幾つも報告されてきた。しかし、それらの実験にはプロテアーゼを多種・多量に含む血清を用いているため、どのプロテアーゼ分子種が関与しているか明らかではない。
[本年度]我々は、高率に筋管を形成するため試験管内の筋分化誘導系として最も良く用いられているマウスのC2C12細胞を使用して、無血清培養条件で効率に筋分化を誘導できる合成培地やサプリメントの種類や濃度について種々検討した。 [成果1]筋分化を誘導できるだけでなく、従来の血清添加培地よりも明らかに分化を促進する完全無血清培養条件を見いだしたので、論文として発表した(Goto S.et al.)。[今後]この無血清分化誘導系を用いて、分化段階特異的に分泌されるプロテアーゼ分子種とインヒビター検索を、改良したザイモグラフィーとウエスタンブロットなどによる蛋白質レベルとRT-PCRなどによる遺伝子発現のレベルで同定を試みている。また、セリンプロテアーゼやメタロプロテアーゼに特異的なインヒビターを分化誘導培養系に添加することで、筋分化におけるプロテアーゼ分子種の同定との役割を明らかにしようとしている。
[成果2・3]上記の研究を遂行するために、プロテアーゼ活性を検出するためのザイモグラフィー法の条件を改善・整理して発表した(宮崎、1999)。また、蛋白質の分離・同定のためのクロマトグラフィーの条件などを整理して、まとめたものを発表した(安光、1999)。

Research Products

• [Publications] Gtoto S.: "Serum-free culture conditions for mouse myoblasts differentiation."Analytical Biochemistry. 272. 135-142 (1999)
• [Publications] 宮崎香: "最新電気泳動実験法"医歯薬出版. 6 (1999)
• [Publications] 安光英太郎: "改訂 蛋白質実験ノート(上)"羊土社. 44 (1999)