ニューロンで発現するギャップ結合チャネル蛋白質の解析と細胞内調節機構

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11680794
• Research Institution: Fujita Health University
• Principal Investigator: 宮地 栄一 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (90129685)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山内 理充 藤田保健衛生大学, 医学部, 講師 (30278303) ; 日高 聡 藤田保健衛生大学, 医学部, 講師 (00228735)
• Keywords: 網膜 / 脳 / ギャップ結合 / 細胞間連絡 / コネキシン・ファミリー / コネキシン36 / RT-PCR / Western blot

Research Abstract

本年度はギャップ結合を構成しているチャネル蛋白質であるコネキシン・ファミリーの内、ニューロンに特異的と考えられるコネキシン36について、アミノ酸配列の解析および抗体の作製を行った。Wister系白色ラット網膜組織で発現しているコネキシンをコードするmRNAをRT-PCR法を用いてクローニングした。脳内ニューロンのギャップ結合チャネル蛋白コネキシン36(Condorelli et al., Eur. J. Neurosci. 10(3):1202-1208,1998)のcDNAの一部をプライマーとしてラット網膜組織のmRNAをRT-PCR法で解析した結果、用いたcDNAプライマーに対して特異的なRCR産物を得た。脳コネキシン36プライマーに対するPCR産物を精製し、pGEM-T Easy VectorにT/Aクローニングを実施した。組み換え完了後のvectorを検体とし、vector由来のユニバーサルプライマーを用いて、二重鎖DNAの両側よりsequenceを実施した。得られたDNA塩基配列を基に両側よりprimer walking法により塩基配列の全長を決定した。その結果、これまでに報告された脳内ニューロンのコネキシン36と同一のコネキシン36がWister系白色ラットの網膜ニューロンから得られた。
次にコネキシン36の321個のアミノ酸配列から合成ペプチドを作製して、それに対する抗体を作製した。作製・精製した合成ペプチドをキーホルリンペットヘモシアニンと結合させ、これを抗原としてウサギに6回ブーストした後、血清を採取した。抗血清をELISA法で抗体価を検定した後、抗体を合成ペプチドを用いたアフィニテイーカラムで精製した。Western blot法による解析から、成熟ラットの嗅球と生後直後の幼弱ラットの大脳皮質で分子量30kDa付近の抗体陽性の特異バンドを検出した。

Research Products

• [Publications] Fusao Kawai & Ei-ichi Miyachi: "Odorants suppress voltage-gated currents in retinal horizontal cells in goldfish"Neuroscience Letters. 281(2-3). 151-154 (2000)
• [Publications] 宮地栄一: "電気シナプスとgap junction の構築と機能"脳の科学「特集 細胞の接着と神経系」. 21巻9号. 937-942 (1999)
• [Publications] 宮地栄一: "網膜ニューロンのギャップ結合"日本医事新報. 3936号. 30-32 (1999)
• [Publications] Ei-ichi Miyachi (分担) ed. by J. Toyoda et al.: "Light responses of horizontal cells. In : The Retinal Basis of Vision"Elsevier Science B. V.. 290ページ中10ページ分担 (1999)
• [Publications] Ei-ichi Miyachi (分担) ed. by J. Toyoda et al.: "Electrical couplings of retinal neurons. In : The Retinal Basis of Vision"Elsevier Science B. V.. 290ページ中14ページ分担 (1999)