2000 Fiscal Year Annual Research Report
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11694206
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| Research Institution | Kyoto Institute of Technology |
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Principal Investigator |
小田 耕平 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 教授 (50081584)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
尾山 廣 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 講師 (50221700)
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| Keywords | カルボキシルプロテアーゼ / 構造と機能 / 分子進化 / 遺伝病 / CLN2 / サブサイト構造 / 一次構造 / 立体構造 |
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| Research Abstract |
ペプスタチン非感受性CPのうち、Pseudomonas sp.101CP(PCP),Xanthomonas sp.CP(XCP),Bacillus coagulans CP(J-4),Bacillus novosp.MN-32(kumamolysin)とヒト起源のCLN2を対象として一連の研究を行い、以下の成果を得た。
1.一次構造 J-4酵素遺伝子のクローニングに成功した。これで全ての一次構造が判明した。
2.サブサイト構造 Kumamolysinの基質特異性を解析した。本酵素のS2サブサイトは極めて狭いこと、また、32'サブサイトは、他の細菌由来ペプスタチン非感受性CPと同様、親水性のアミノ酸残基で構成されていることが明らかとなった。
3.触媒残基 CLN2と4種の細菌由来のCPについてそれらの触媒残基、特にSer残基の関与について、部位特異的改変体を作成し検討した。その結果、若干の問題を残すものの、これらCPの触媒残基はAsp,Glu,Serで構成されていると結論した。
4.立体構造 PCPの立体構造を明らかにすることができた(Nature Structural Biology2001年5月掲載予定)。(1)PCPの立体構造は、基本的にセリンプロテアーゼであるサブチリシンBPN'と類似すること、(2)触媒残基は、Asp84,Glu80,Ser287で構成されていること等が示された。Ser残基を触媒残基とするCPの報告は無く、これらのCPは,全く新しいタイプのプロテアーゼであることが構造的にも明らかとなった。著者らは、このプロテアーゼ群を第5番目のプロテアーゼ群と位置づけ、これをセリンーカルボキシルプロテアーゼと命名した。
平成12年11月10日京都工芸繊維大学において"KIT International Conference on Proteinases and Their Inhibitors"と題して国際会議を開催した。
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[Publications] A.Wlodawer: "Carboxyl proteinase from Pseudomonas defines a novel family of subtilisin-like enzymes"Nature Structural Biology. May I. (2001)
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[Publications] S.Fujiwara: "Effect of pressure on the activity and spectroscopic properties of carboxyl proteinases Apprent correlation of pepstation-insensitive-"Eur.J.Biochem.. 268. 645-655 (2001)
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[Publications] K.Oda: "Subsite preferences of pepstatin-insensitive carboxyl proteinases from prokaryotes : Kumamolysin, a thermostable pepstatin-insensitive-"J.Biochem.. 128. 499-507 (2000)
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[Publications] K.Shimuta: "Expression and secretion of Scytalidopepsin B, an acid protease from Scytalidium lignicolum, in Yeast"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64. 1542-1546 (2000)
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[Publications] J.Ezaki: "Characterization of endopeptidase activity of tripeptidyl peptidase-1/CLN2 protein which is deficient in classical late infantile neuronal ceroid-"Biochem.Biophys.Res.Comm.. 268. 904-908 (2000)
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[Publications] H.Oyama: "Identification of catalytic residues of pepstatin-insensitive carboxyl proteinases from prokaryotes by site-directed mutagenesis"J.Biol.Chem.. 274. 27815-27822 (1999)
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[Publications] M.Ito: "Identification of carboxyl residues in pepstatin-insensitive carboxyl proteinase from Pseudomonas sp.101 that participate in catalysis and-"J.Biochem.. 125. 210-216 (1999)
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[Publications] S.Narutaki: "Subsite preferences of pepstatin-insensitive carboxyl proteinases from bacteria"J.Biochem.. 125. 75-81 (1999)
