1999 Fiscal Year Annual Research Report
血管平滑節トーヌス制御における新しいシグナル伝達の解析と病態におけるその異常
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11694261
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
伊藤 正明 三重大学, 医学部・附属病院, 講師 (00223181)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中野 赳 三重大学, 医学部, 教授 (60111879)
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| Keywords | 平滑節 / ミオシンホスファターゼ / Rhoキナーゼ |
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| Research Abstract |
(1) 平滑節Rhoキナーゼの精製と性状解析
平滑節精製RhoキナーゼはSDS電気泳動上160kDの蛋白質で、部分アミノ酸シークエンス解析よりROKαに属することが判明した。Rhoキナーゼはミオシンホスファターゼ(MP)のMYPT1サブユニットを燐酸化し、MP活性はRhoキナーゼによるMYPT1のチオ燐酸化により抑制された。また、平滑節Rhoキナーゼはミオシン(20kD軽鎖のSer19)を燐酸化し、この燐酸化によりミオシンのアクチン活性化ATPaseが上昇した。Y-27632及びstaurosporineによりRhoキナーゼ活性は強く阻害され、そのKi値は各々0.09、0.02mMであった。平滑節RhoキナーゼはGTPrS・RhoAにより1.5〜2倍、トリプシン処理によりRhoA非依存性に5〜6倍活性化された。さらに数10mM程度のアラキドン酸は、Rhoキナーゼ活性をトリプシン処理で認められる最大値までRhoA非依存性に活性化させた。
(2) Rhoキナーゼの燐酸化によるMP活性制御の分子機構
Rhoキナーゼの燐酸化よるMP活性の阻害は、主に最大酵素反応速度(Vmax)の低下によるものであった。ROKはMYPT1のC端側1/3のフラグメントに存在するスレオニン残基(Thr)を燐酸化した。そこで、この領域に存在するThr残基をアラニンに置換したミュータントを作製し、それら燐酸化レベルを検討したところ、695番目(Thr695)と850番目のThrが主なる燐酸化部位であることが明らかになった。これらの部位の燐酸化のMP活性に与える影響を検討したところ、Thr695の燐酸化が活性阻害に関与すると考えられた。Thr695の燐酸化を特異的に認識する抗体により、Rhoを活性化させる刺激(LPA)により培養線維芽細胞でThr695の燐酸化レベルの上昇が確認され、この燐酸化はROK阻害剤Y-27632により阻害された。
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[Publications] Jianhua Feng: "Rho-associated kinase of chicken gizzard smooth muscle"Journal of Biological Chemistry. 274. 3744-3752 (1999)
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[Publications] Mamoo Nakamura: "Effects of the phosphorylation of myosin phosphatase by cyclic GMP-dependent protein kinase"Cellular Signaling. 11. 671-676 (1999)
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[Publications] Jianhua Feng: "Dephosphorylation of distinct sites on the 20kDa myosin light chain by smooth muscle myosin phosphatase"FEBS Letters. 448. 101-104 (1999)
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[Publications] Jianhua Feng: "Inhibitory phosphorylation site for Rho-assocrated kinase on smooth muscle myosin phosphatase"Journal of Biological Chemistry. 274. 37385-37390 (1999)
