1999 Fiscal Year Annual Research Report
ジーンノックアウト法によるヒストン修飾酵素の機能解析による共同研究
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11694299
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | 宮崎医科大学 |
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Principal Investigator |
中山 建男 宮崎医科大学, 医学部, 教授 (60031712)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
武田 俊一 京都大学, 大学院・医学研究科, 教授 (60188191)
菊池 秀彦 宮崎医科大学, 医学部, 助手 (10301384)
高見 恭成 宮崎医科大学, 医学部, 講師 (80236356)
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| Keywords | ジーンノックアウト法 / ヒストンデアセチラーゼ / 転写制御 / 免疫グロブリン / 細胞増殖 / DT40株 / クロマチン構造 |
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| Research Abstract |
1) chHDAC-1,2,3,4のcDNAをクローニングし、それらの特異抗体も作成した。chHDAC-1,2は核に局在し、chHDACー3は細胞質と核の双方に存在する。
2) chHDAC-1,2,4の欠失ホモDT40変異株(ΔchHDAC-1、ΔchHDAC-2、ΔchHDAC-4)は作成した。2DーPAGE上でΔchHDAC-1と4の総蛋白質は野生株のそれと差異がなく、ΔchHDAC-2の2D-PAGEパターンには顕著な変化が認められた。
3) ΔchHDAC-2で著しく増加した蛋白質のアミノ酸配列を決定したところ、IgMH-chainとL-chainに合致した。Western、 FACS分析で、H-chainの分泌型の増大、膜結合型の減少、RNase protection assay, nuclear run-off assayで、H-chain gene転写の増大、H-chain pre-mRNAのμmからμsへのalternative processingの増大が認められた。chHDAC-2はH-chain量をその転写と膜型から分泌型へのスイッチングの2つのステップでコントロールしていることを示している。
4) chHDAC-3は chHDACー1,2 と比べて、C-末端側の約50アミノ酸が欠如し、さらに、N-末端およびC-末端側でのホモロジーも低い。細胞増殖に必須である本酵素に関して、tet-inducible conditional homozygous mutant を作成した。本変異株は tet 添加後24時間でFLAG-tagged HDAC-3が検出出来なくなり、しばらくは正常に増殖するが、以後、増殖速度が遅くなり、死滅する。増殖にはchHDAC-3のN-末端側の約25個のアミノ酸、C-末端側の約30個のアミノ酸、核外輸送シグナル(NES)とデアセチラーゼ活性それ自体が必須である。
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Research Products
(6 results)
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[Publications] Ahamad,A.et al.: "WD repeats of the p48 subunit of chicken chromatin assembly factor-1 required for in vitro interaction"J.Biol.Chem.. 274. 16646-16653 (1999)
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[Publications] Takami,Y.et al.: "Chicken histone deacetyase-2 controls the amount of the IgM H-chain at the steps of both transcription"J.Biol.Chem.. 274. 23977-23990 (1999)
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[Publications] Takechi,S.et al.: "Sas3 is a histone acetyltransferase and requires a zinc finger motif"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 266. 405-410 (1999)
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[Publications] Nakayama,T.et al.: "Interaction of the p48 subunit of chicken chromatin assembly factor-1 with histone deacetylases"Current Topics in Biochemical Research. 1. 173-178 (1999)
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[Publications] Takami,Y.et al.: "Histone HI variants play individual roles in transcription regulation in the DT40 chicken B cell line"Biochem.Biophys.Res.Commun.. (in press). (2000)
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[Publications] Takami,Y.et al.: "N-terminal region,C-terminal region,nuclear export signal and histone deacetylase activity of histone"J.Biol.Chem.. (in press). (2000)
