DNAチップによる疾患原因の探索:リボソーム蛋白遺伝子マイクロアレイの開発

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11694300
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: University of the Ryukyus
• Principal Investigator: 剣持 直哉 琉球大学, 医学部, 助手 (00133124)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田中 龍夫 琉球大学, 医学部, 教授 (70018688)
• Keywords: リボソーム / DNAチップ / 疾患原因遺伝子 / リボソームタンパク質 / マイクロアレイ / ゲノム

Research Abstract

本研究は、国内で研究が遅れているDNAチップを実用化するために、この分野ですでに実績をあげているタルト大学(エストニア)のMetspalu博士と共同でリボソーム蛋白質遺伝子群をターゲットとしたDNAチップを作製し、それを用いて疾患とリボソームとの関連を解明することを目的としている。本年度は、剣持がタルト大学にてMetspalu博士とともに予備的な実験を行い、以下のような結果を得た。
[結果]
1.リボソームタンパク質遺伝子に特異的な合成DNAを均一にガラススライドに固定した。今回はリボソームの小サブユニットの33個についてのみ行ったが、今後はこの方法で80個すべてをチップ化できると考えられる。
2.ヒトがん培養細胞よりハイブリダイゼーション用のプローブを作製する方法について検討した。プローブを標識する効率を上げるために、鋳型としてmRNAを用いた場合とトータルRNAの場合を比較した。トータルRNA用いる場合は、mRNAの場合に較べて、迅速なRNA調製が可能なため、比較的に安定して標識することができた。今後は、定量性を検討して最適化をはかる必要がある。
3.チップ上でプローブとのハイブリダイゼーションを行った。今回は反応を長時間(18時間)行ったため、反応液の蒸発が問題となった。今後は、反応チャンバーを開発し、ハイブリダイゼーションが完全に行われるようコントロールする必要がある。
4.Metspalu博士らが開発した蛍光検出器を使用して、ハイブリダイゼーションしたプローブのシグナルを測定した。この検出器はもともとプライマー伸長法によるシグナルの測定のために開発されているため、ハイブリダイゼーション用としては充分な感度が得られなかった。今後は、プローブの量を増やす、標識の効率を上げる等の改良が必要と思われる。

Research Products

• [Publications] Higa,S.,Yoshihama,M.,Tanaka,T.,Kenmochi,N.: "Gene organization and sequence of the region containing the ribosomal protein gene RPL13A and RPS11 in the human gemome and conserved features in the mouse genome."Gene. 24. 371-377 (1999)