1999 Fiscal Year Annual Research Report
出芽酵母ゴルジ体の精製法の開発及びそれらを用いた逆行小胞輸送の解析
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11760055
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
野田 陽一 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助手 (90282699)
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| Keywords | 出芽酵母 / ゴルジ体 / SED5 / SNARE / 免疫沈降 |
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| Research Abstract |
出芽酵母のearly Golgi膜画分を免疫学的に単離するためのタグとして、early Golgiで機能するt-SNAREであるSed5蛋白を選択した。myc6-Sed5の融合蛋白をコードする配列を染色体上のSED5遺伝子と置換してmyc6-Sed5を唯一のSed5蛋白として持つ株を作製した。この株から坑myc抗体を用いて免疫沈降することによりSed5蛋白質の局在する膜画分(Sed5 vesicles)を単離することを試みた。免疫沈降で回収された膜画分をTriton X-100で可溶化した後にSed5 vesiclesに含まれる蛋白をSDS-PAGEとウェスタンブロッティングにより解析した。今まで存在の知られているマーカー蛋白による抗体を用いてSed5 vesiclesに存在する蛋白を調べたところ、Golgi体で蛋白の糖鎖修飾に関係しているMntl,Van1,Mnn9蛋白とER-early Golgiの膜輸送で機能しているYpt1,Sec22蛋白が多く回収されているのに対してERに局在する蛋白であるSec71蛋白とlate-Golgiに存在するプロテアーゼであるKex2蛋白はほぼ完全に除かれていた。さらにSed5 vesiclesを大量に調製、2次元電気泳動により分離してその構成蛋白質をプロテインシークエンシングにより固定した。その結果、ERから出芽するCOPII小胞へのカーゴの蛋白の濃縮に機能しているEmp24,Erv25,Erp1などの膜蛋白が見いだされた他、機能未知の膜蛋白であるYm1067cmも見いだされた。以上の結果からSed5をタグとして用いた免疫沈降により出芽酵母のearly,medial Golgi膜画分が効率よく単離できることがわかった。またYML067c遺伝子の解析も進めており、遺伝子欠損株の作製、HAあるいはmycタグの連結して局在、共沈してくる蛋白を検索することによりそのERあるいはGolgi体での機能を調べている。
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