2000 Fiscal Year Annual Research Report
出芽酵母ゴルジ体の精製法の開発及びそれらを用いた逆行小胞輸送の解析
Project/Area Number |
11760055
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Research Institution | The University of Tokyo |
Principal Investigator |
野田 陽一 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助手 (90282699)
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Keywords | 出芽酵母 / ゴルジ体 / SED5 / TLG2 / SNARE / 免疫沈降 |
Research Abstract |
平成11年度には,出芽酵母early Golgiに局在するt-SNAREであるSed5蛋白質にmycタグを連結して免疫沈降法によりearly Golgi画分を特異的に濃縮することに成功した.本年度はlate Golgiに局在するt-SNAREであるTlg2蛋白質にmycタグを連結して同様の方法によりlate Golgi膜画分(Tlg2 vesicle)の精製を試みた.取得されたTlg2 vesicleに存在する蛋白質をまずウエスタンブロッテイングによりSed5 vesicleの蛋白と比較した.ER-Golgi間の膜輸送に関わるv-SNAREであるSec22蛋白質とゴルジ体での蛋白質の糖鎖修飾に関わるMnn9蛋白はSed5 vesicleに多く存在し,Tlg2 vesicleにはほとんど見いだされなかった.それに対してlate Golgiで働くエンドプロテアーゼであるKex2蛋白質はTlg2 vesicleにのみ存在し,late Golgiから出芽した輸送小胞のv-SNAREであるVti1とSft1蛋白質はそのほとんどがTlg2 vesicleに存在した.これらの結果はTlg2 vesicle画分にはlate Golgi膜画分が濃縮されていることを示しており,本研究により出芽酵母のearlyとlate Golgi体画分を簡便に分離精製することが可能になった.さらにまたSed5 vesicleとTlg2 vesicleを大量に調製して存在する蛋白質を2次元電気泳動により分離して両者のプロファイルを比較した.Tlg2 vesicleにのみ存在する蛋白質5種類に注目して,N末プロテインシークエンスにより同定を試みた.うち一つはlate Golgiから液胞へ輸送される蛋白質のレセプターであるVps10/Pep1であった.他の蛋白質についてはTOF-MSによる同定を行っている.
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[Publications] J-H.Cho,Y.Noda and K.Yoda: "Proteins in the early Golgi compartment of Saccharomyces cerevisiae immunoisolated by Sed5p"FEBS Letters. 469. 151-154 (2000)
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[Publications] K.Yoda,T.Kawada,C.Kaibara,A.Fujie,M.Abe,H.Hashimoto,J.Shimizu,N.Tomishige,Y.Noda,and M.Yamasaki: "Defect in cell wall integrity of the yeast Saccharomyces cerevisiae caused by a mutation of the GDP-mannose pyrophosphorylase gene VIG9"Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64(9). 1937-1941 (2000)
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[Publications] K.Yoda and Y.Noda: "Vesicular transport and the Golgi apparatus in yeast"Journal of Bioscience and Bioengineering. 91(1). 1-11 (2001)