Na^+/Ca^<2+>交換機構(NCX)遺伝子を発現させた細胞におけるNCX電流の検討

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11770047
• Research Institution: Fukushima Medical University
• Principal Investigator: 綿野 智一 福島県立医科大学, 医学部, 助手 (60301404)
• Keywords: NCX1遺伝子 / Ca^<2+> / Ca^<2+>イオノフォア / NCX電流 / CD-8

Research Abstract

心室筋では,細胞内に高濃度のCa^<2+>を負荷すると強縮するため,NCX電流に対する細胞内Ca^<2+>濃度の影響の詳細な検討は難しい.継代培養可能で,かつ細胞内Ca^<2+>濃度を高くしても強縮しない細胞に,心筋型NCX遺伝子(NCX1)をトランスフェクトして安定発現株をクローン化し,簡便に心筋型NCX電流を測定できる系を確立するため以下の実験を行った.昨年度はNCX1のcDNAを作成,発現ベクター(pcDNA3)にサブクローニングし,各種細胞にリポフェクション法で発現した.何割かの細胞に発現していることはRT-PCRにより確認したが,発現した細胞を選別できなかった.
(1)NCX1を過剰発現した細胞の選別;NCX1が過剰発現した細胞は,細胞内にCa^<2+>を負荷してもNCX1が上昇した細胞内Ca^<2+>を排出するため細胞死を起こさないことが知られている.このことを利用してNCX1が過剰発現した細胞細胞のみを選別するために,細胞の培地中にCa^<2+>イオノフォアA-23187あるいはイオノマイシンを加えて培養を試みた.Ca^<2+>イオノフォアの濃度を検討したが選別できなかった.
(2)CD-8を発現させると金属のビーズを細胞のまわりにつけるために,可視的に発現細胞を見分けることができる.現在,CD-8とNCX1を共発現させる手法を検討中である.発現させるCD-8とNCX-1のcDNAの量とその比率時間などの検討を行なっている.共発現ができた後細胞に金属のビーズをまき,ビーズのついた細胞を指標にNCX1発現細胞と考え,NCX電流の測定を行う予定である.

Research Products

• [Publications] Yasuhide Watanabe,Takahiro Iwamoto,Isao Matsuoka,Satoko Ohkubo,Tomoyuki Ono,Tomokazu Watano,Munekazu Shigekawa & Junko Kimura: "Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na^+/Ca^<2+> exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes"Br.J.Pharmacol.. 132. 1317-1325 (2001)