冠攣縮の病院解明:eNOS遺伝子(-786C)の転写を抑制するRPAの意義

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11770389
• Research Institution: Research Institute for Production Development
• Principal Investigator: 宮本 恵宏 財団法人 生産開発科学研究所, 成人病科学研究室, 研究員 (10312224)
• Keywords: 転写抑制因子 / 内皮型一酸化窒素合成酵素 / 分子生物学

Research Abstract

1.RPA1によるeNOS遺伝子の転写抑制機構の解明
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞に、内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子(eNOS)遺伝子の野生型及び変異型プロモーターを繋いだルシフェレースレポーター遺伝子をトランスフェクションし、転写活性を比較したところ野生型プロモーターに比べ変異型プロモーターはその転写活性は約20%の低下を認めた。さらにreplication protein A1 (RPA1) の発現ベクターを共発現させたところ、eNOS遺伝子の変異型プロモーターの転写活性はさらに低下した。RPA1のアンチセンスによりRPA1の発現を抑えたところeNOS遺伝子の変異型プロモーターと野生型プロモーターの転写活性の差は消失した。これらのことからRPA1が変異型eNOS遺伝子の転写活性を抑えることが明かとなった。また、変異部位を3回くり返し配列をSV40のプロモーターに繋いだ遺伝子の転写活性はSV40の転写活性を約50%低下させた。これより、このRPA1による遺伝子発現抑制作用はeNOS以外の遺伝子の転写活性にも作用することが示唆された。
2.欠失蛋白を用いたRPA1の機能解析
RPA1はこれまで、DNAの複製及び修復に関与するタンパク質としてssDNA結合部位、RPA2やp53との結合部位などが明らかにされているが、double strand DNA (dsDNA)との結合、転写抑制活性については未だ明らかではない。そこで、RPA1 cDNAより作製したリコンビナントRPA1を用いてeNOS遺伝子の変異配列をプローブにしたゲルシフトアッセイを行い、結合して移動度の異なるシフトバンドを認めた。またそのシフトバンドはRPA1に対する特異抗体により結合が阻害され消失した。このことからRPA1が変異配列に結合することが明かとなった。現在、RPA1部分欠失蛋白を用いてその結合部位を同定中である。

Research Products

• [Publications] M. Ishikawa: "Heart-specific increase in cardiotrophin-1 gene Expression precedes establishment of ventricular hypertension in genetically hypertensive rats"J.Hypertens.. 17・6. 807-816 (1999)
• [Publications] K.Kuwahara: "The Effects of the selective ROCK inhibitor, Y27632, on ET-1-induced hypertrophic responses in neonatal rat cardiac myocytes-possible involvement of Rho/ROCK pathway in cardiac muscle cell hypertrophy-"FEBS Letters. 452・3. 314-318 (1999)
• [Publications] M.Nakayama: "T-786 C mutation in the endothelial nitric oxide synthase gene is associated with coronary spasm : reduction in promoter activity"Circulation. 99・22. 2864-2870 (1999)
• [Publications] K.Kuwahara: "Involvement of cardiotrophin-1 in cardiac myocyte-nonmyocyte interactions during hypertrophy of rat cardiac myocytes in vitro"Circulation. 100・10. 1116-1124 (1999)