睡眠・覚醒リズム障害におけるヒト時計遺伝子Clockの解析

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11770558
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 岩瀬 利郎 埼玉医科大学, 医学部, 助手 (80306307)
• Keywords: 睡眠・覚醒リズム障害 / Clock遺伝子 / PCR / SSCP / 遺伝子変異

Research Abstract

この研究開始当初はヒト時計遺伝子であるClock遺伝子のゲノム構造は公表されていなかったので,初めにゲノム構造の解析を行った.つまり,既に報告されているClock遺伝子のcDNAの核酸配列から,タンパク質をコードしていないexon1を除くexon2-21の配列を基にそれぞれプライマ-を作成し,TaKaRa LA PCR Kitを使ってイントロン部分を含むゲノムDNAを増幅した.PCR(polymerase chain reaction)産物をプラスミドベクターpCRIIにサブクローニングするか,またはPCR産物を用いたdirect sequencingによって,Clock遺伝子の各エクソンの両側のイントロン部分の塩基配列を明らかにした.次にその配列を基に,全エクソンを増幅できるようにPCRプライマ-を設計した.PCR産物の長さは200-300 base pairsになるようにした.
睡眠相後退症候群,非24時間睡眠覚醒症候群,周期性傾眠症など合計で40例のリズム障害患者のゲノムDNAを鋳型として,上記のプライマ-を用いてPCRを施行し,SSCP(single-stranded conformation polymorphism)法により塩基配列の変異の有無を探った.その結果患者40例中exon18で19例,exon17で1例,exon21で7例通常と異なる移動度のバンドを検出した.これらの異常なバンドは塩基配列の変異の存在を示唆する所見であり,現在塩基配列を解析し,正常ボランティア中での頻度と比較中である.