プロスタシンによるNaチャネル活性化の分子生物学的機構と高血圧治療への応用

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11770599
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 北村 健一郎 熊本大学, 医学部, 助手 (10304990)
• Keywords: ナトリウム チャネル / セリン プロテアーゼ / プロスタミン

Research Abstract

1.プロスタシンによるENaC活性化機構の解明
(1) Invitro transcriptionにより合成したENaCのα、β、γサブユニットそれぞれのcRNAを単独またはプロスタシンのcRNAと共に実体顕微鏡下でアフリカツメガエルの卵母細胞にmicroinjectionし、24〜48時間後にその細胞膜分画をショ糖密度勾配法により精製した。得られた細胞膜蛋白質を可溶化してSDS-PAGEを行い、ENaCのそれぞれのサブユニットに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った。αおよびβサブユニットに対する抗体を用いたウエスタンブロットではサイズに変化はなかったが、γサブユニットに対する抗体ではプロスタシンの共発現により85kDaのバンドが70kDaにシフトしていることが判明した。
(2) (1)の知見にもとづき、プロスタシンがγサブユニットのN末端から約15kDaのところを切断すると仮定した。γサブユニットのそれに対応する場所としてRKRR(a.a.135-138)という配列を切断部位と想定し、site-directed mutagenesisによりRKRRをAAAAに変異させたmutantγサブユニットを作成した。アフリカツメガエルの卵母細胞にmutant ENaCのcRNAとプロスタシンのcRNAをmicroinjectionし、24〜48時間後に、アミロライド感受性Na電流を双電極膜電位固定法を用いて測定した。膜電位を-100mVに保持して、5μMのアミロライドによって阻害される電流を測定したところ、AAAAmutantではプロスタシンの共発現によるENaCの活性化が阻害されていることが判明した。この実験からプロスタシンによるENaCの活性化にはγサブユニットが必要であり、さらに、RKRR配列が活性化のために必要な部位であることが証明された。