分子シャペロンとしての細胞質甲状腺ホルモン結合蛋白(CTBP)の機構について

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11770628
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 鈴木 悟 信州大学, 医学部, 助手 (30222061)
• Keywords: 甲状腺ホルモン / クリスタリン

Research Abstract

1)ヒトCTBPのクローンをPCR法により増幅し、myc蛋白との融合蛋白を哺乳類の細胞で発現させるためpCDNAmyc(Invitrogen)にクローニングした。同じように、クラゲの蛍光蛋白質であるAutofluorescent protein(AFP)と融合蛋白を発現させるためpQBl(Quantum)にクローニングした。
2)シークエンスを確認後、CHO細胞に発現後、NADPH依存性T3結合を確認した。CHO細胞にCTBPの活性が無いことは確認済みである。
3)pCDNAmyc、pQBlにNeomycin耐性の遺伝子がついているので、CHO細胞にトランスフェクションしたのちG418で細胞を選択しクローニングした。
4)幾つかクローニングした細胞を増やし、NADPH依存性T3結合を確認した。同時に、細胞蛋白を調整し、mycのモノクローナル抗体でウエスタンブロッティングをおこなった。
5)発現の確認された細胞をチャンバースライドに培養する。同じ細胞の核、アクチン、ミトコンドリア、細胞膜、小胞体等をそれぞれの蛍光プローブで染め分け、1次抗体としてmycの抗体を、2次抗体としてFITCの抗体を用い蛍光顕微鏡で細胞内局在を観察した。pQBlをトランスフェクションした細胞はそのまま蛍光顕微鏡で観察した。