遺伝子工学の微細操作法を利用した着床前受精卵の遺伝子診断および胚移植に関する研究

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11770966
• Research Institution: Suzuka University of Medical Science
• Principal Investigator: 具 然和 鈴鹿医療科学大学, 保健衛生学部, 助教授 (40298667)
• Keywords: 着床前期 / 遺伝子構造 / 人工受精 / Single stranded conformational polymorphism / Denaturing gredient gel electrophoresis / Squeezing method / FISH / PCR

Research Abstract

本研究では、着床前期の受精卵の単一遺伝子異常による遺伝疾患および染色体異常による奇形を検討した。2細胞期から8細胞期(桑実胚)の細胞を取りだし、細胞遺伝学的調査、蛍光染色による卵染色体の観察(FISH法)、遺伝子構造の観察(PCR法:single cell PCR,multiplex PCR)などによる着床前の遺伝子診断を行った。また、受精後、48時間〜72時間に卵管を貫流し、受精卵細胞を採取した。その後、modified Krebs-Ringers Bicarbonate(m-KRB)培養液に集め、90分間培養した後、顕微鏡上で卵細胞検査操作を行った。また、発情期にある雌マウスの卵管を貫流し、卵細胞を採取した。その後、以上と同じ方法で、卵を集めた。そして、雄マウスから採取した精子で人工受精を行った。その後、受精18日後に解剖し、受精率を確認した。その結果25%の確立で受精が成立した。また、採取した受精卵細胞の単一受精卵細胞のDNA量は、非常に微量のため、PCRは困難である。従って、Primer extension preamplification(PEP)を通じて全ての遺伝子を一次増幅した後、SSCP(Single stranded conformational polymorphism)およびDGGE(Denaturing gredient gel electrophoresis)を通じて遺伝疾患を検定した。しかし、突然変異がある場合は、dideoxytermiantion方法を利用したcyclic sequencing方法で突然変異が起こった部位の塩基配列を確認した。FISH法による受精卵細胞の検査は、人工受精卵を約48〜72時間培養し、4〜8細胞の卵細胞の内、二個の卵細胞を取りだし、RNaseの処理後、脱水し、常温で乾燥させた。体外受精された人工受精卵を約2〜3日培養し、4〜8細胞における卵細胞から単一細胞を取りだし、PCRおよびSSCPを正確に行った。そして、stock SolutionでHybridization Bufferを作る。その後、蛍光染色過程に従って染色を行った。また、MItotic Index,Pyknosis,Micronucliなどを観察した。