1999 Fiscal Year Annual Research Report
骨型アルカリ性ホスファターゼ遺伝子発現を制御する転写因子群のクローニング
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11771133
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
出山 義昭 北海道大学, 歯学部, 助手 (80271667)
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| Keywords | 骨型アルカリ性ホスファターゼ / 遺伝子発現 / 転写因子 / クローニング / 骨芽細胞 |
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| Research Abstract |
近年、骨芽細胞分化決定因子Cbfa1/Osf2が発見され、大きな反響を呼んでいる。Cbfa1ノックアウトマウスは硬組織(骨)の形成を招いた。一方、オステオカルシン、BSPなどはCbfa1により直接的に支配されているが、アルカリ性ホスファターゼ、I型コラーゲンはCbfa1をノックアウトしても骨芽細胞において発現していることが報告されている。Cbfa1の発現は、硬組織形成を担う因子の発見として決定的ではあったが、アルカリ性ホスファターゼノックアウトマウスにおいても骨の石灰化が抑制されており、硬組織形成におけるアルカリ性ホスファターゼの関与は度外視できないと考えられる。骨芽細胞の分化マーカーであるアルカリ性ホスファターゼ発現を支配する転写因子は一部判明しているが、未だ不明の部分が多く、更なる転写因子の存在が推測される。
現在のところ、我々はアルカリ性ホスファターゼのプロモーター領域の解析、転写因子クローニングを目的として予備実験を進めている。ALP遺伝子の5'上流域のAACAAATGAAAACAAACCCAGGCAという配列はループを形成するため、この部位にタンパク質が結合すると考えられる。MC3T3-E1細胞の長期培養時にALPmRNAの発言がconfluence後14日目にピークを迎えた。そこで、この部位のオリゴヌクレオチドを用いてゲルシフトアッセイを行うとDNA結合活性が認められ、その結合活性のピークはmRNA発現のピーク時期と一致する。
この時期の核タンパク質を利用して、DNA親和性クロマトグラフィーを行ったところ、3種類のタンパク質が検出された。しかし、銀染色で染まる程度しか回収できなかった。そこでこの配列を数個結合させたものを作製し、この配列に結合する蛋白質を現在精製中である。
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