破骨細胞性骨吸収における小胞輸送関連シグナル伝達遺分子の発現の解析

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11771185
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 山座 孝義 九州大学, 歯学部, 助手 (80304814)
• Keywords: 破骨細胞 / 骨吸収 / 分泌 / 小胞輸送 / 小胞輸送蛋白 / 膜輸送 / 膜輸送蛋白 / Rab蛋白ファミリー

Research Abstract

(1)ラット長管骨からの破骨細胞の単離とノーザンおよびウエスタン解析によるRab3A,5AのmRNAおよび蛋白の発現の解析について。生後1日のラット長管骨より採取した骨髄を培養プレートに播種し、破骨細胞の単離をおこなった。単離破骨細胞より全RNAおよび全蛋白を抽出し、電気泳動後、メンブレンに転写した。DIG標識オリゴDNAプローブとハイブリダイゼーションまたは抗Rab 3A,5A抗体による免疫反応をおこない、Rab 3A,5A mRNAおよび蛋白のシグナルの検知をおこなった。しかしながら破骨細胞のみの単離は困難であり、またRab3A,5AmRNAおよび蛋白のシグナルの強度が弱かった。破骨細胞を純粋でかつ大量に単離し、さらに抽出するtotal RNAおよび蛋白の量および質の効率化が現在の検討課題である。
(2)in situ hybridization法による破骨細胞におけるRab 3A,5A mRNA発現の検索について。4週齢ラットを灌流固定後、脛骨を採取し、4μm凍結切片を作製し、DIG標識オリゴDNAプローブをもちいたin situ hybridization法を施行した。残念ながらRab3A,5AmRNAのシグナルは、弱いか検知することができなかった。したがって現在、プローブの設計の再検討中である。
(3)免疫組織化学法による破骨細胞におけるRab 3A,5Aの局在の検索について。蛋白質レベルでのRab3A,5Aの局在を検討するために、灌流固定した脛骨より1μm凍結切片を作製し、抗Rab3A,5A抗体をもちいて、ABC法により検索した。骨組織において、Rab 3A,5Aは破骨細胞において特に細胞内の構造物および刷子縁相当部に局在していた。現在、免疫電顕法を用い、微細構造学的にRab3A,5Aの局在を検索中である。